植物細胞壁合成酵素および分解酵素を用いた細胞外情報処理空間の動的可視化

• Project Area: Plant cell wall as information-processing system
• Project/Area Number: 24114008
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Research in a proposed research area)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Research Institution: The University of Tokyo
• Principal Investigator: 五十嵐 圭日子 東京大学, 大学院農学生命科学研究科(農学部), 准教授 (80345181)
• Project Period (FY): 2012-06-28 – 2017-03-31
• Project Status: Granted(Fiscal Year 2016)
• Budget Amount: ¥59,150,000 (Direct Cost : ¥45,500,000、Indirect Cost : ¥13,650,000); Fiscal Year 2016 : ¥13,130,000 (Direct Cost : ¥10,100,000、Indirect Cost : ¥3,030,000); Fiscal Year 2015 : ¥13,130,000 (Direct Cost : ¥10,100,000、Indirect Cost : ¥3,030,000); Fiscal Year 2014 : ¥13,130,000 (Direct Cost : ¥10,100,000、Indirect Cost : ¥3,030,000); Fiscal Year 2013 : ¥13,000,000 (Direct Cost : ¥10,000,000、Indirect Cost : ¥3,000,000); Fiscal Year 2012 : ¥6,760,000 (Direct Cost : ¥5,200,000、Indirect Cost : ¥1,560,000)
• Keywords: 植物細胞壁 / バイオマス / セルロース / セルロース分解酵素 / セルロース合成酵素 / 一分子可視化技術

Outline of Annual Research Achievements

平成27年度も、これまでの研究に引き続き植物細胞壁の生合成および生分解に関わる酵素の取得および可視化に力点を置いた。特にセルロースやヘミセルロースなどの合成酵素の多くは，膜タンパク質であることが知られており、メタノール資化性酵母Pichia patorisなどを用いた異宿主発現系を構築すること自体がチャレンジングな実験であったため、本年度はBrevibacillus choshinensisを用いた発現系に挑戦した。
1）植物由来タンパク質の異宿主発現
本年度は植物細胞壁の生合成過程で重要な役割を担っていると考えられるエクスパンシンやキシログルカンエンドトランスグルコシダーゼ／トランスフェラーゼ（XTH）など、これまでにあまり異宿主発現の例が無いタンパク質に関して、Pichia pastorisおよびBrevibacillus choshinensisを用いた発現系の構築にチャレンジした。その結果AtEXPA17に関してはP. pastorisからB. choshinensisに発現系を変えることで組換えタンパク質の生産に成功した。また、GxCeSAB、AtCeSA1、PpXTH32、AtXTH3、OsCEBiPに関してはP. pastorisで、OsPMT10およびOsPMT16に関してはB. choshinensisによる発現に成功した。それらに関しては論文や学会などでの発表を行っていく予定である。
2）植物細胞壁生分解酵素の可視化
26年度から取り組んでいたPcCel45Aの中性子構造解析に成功し、その成果をScience Advancesに公表するとともに、プレスリリースを行った。さらに本成果の一部がギネス世界記録に登録された。現在バクテリアが生産するセルラーゼの挙動解析に関しても、結果を取りまとめている。

Current Status of Research Progress

1 :  Research has progressed more than it was originally planned.

Reason

研究開始当初は酵素分子の動態解析に利用できる技術が高速原子間力顕微鏡だけであると考えていたが、蛍光顕微鏡を用いた一分子観察や、中性子構造解析によるプロトンリレーのダイナミズムを可視化できたことは、計画以上の成果であったと言える。これらの技術を組み合わせて、研究を遂行していく。

Strategy for Future Research Activity

当初の計画項目であった①植物細胞壁成分の自己組織化，②植物細胞壁分解酵素の基質認識を利用した細胞壁の動的可視化に関する研究は引き続き当初の計画通り遂行していく。さらに昨年度追加された計画項目である③メタノール資化性酵母P. pastorisを用いた植物由来タンパク質の異宿主発現系の構築、④様々な細胞壁成分分解酵素の動的可視化に関しても、本領域の研究を推進する上で重要な成果が期待できることから、引き続き研究を推進していく。

Research Products

• [Int'l Joint Research] VTT Technical Research Centre of Finland(フィンランド)
  • Country Name: フィンランド
  • Counterpart Institution: VTT Technical Research Centre of Finland
• [Int'l Joint Research] Swedish Univ. Agricultural Sciences(スウェーデン)
  • Country Name: スウェーデン
  • Counterpart Institution: Swedish Univ. Agricultural Sciences
• [Journal Article] “Newton’s cradle” proton relay with amide-imidic acid tautomerization in inverting cellulase visualized by neutron crystallography (2015)
  • Author(s): Nakamura, A., Ishida, T., Kusaka, K., Yamada, T., Fushinobu, S., Tanaka, I., Kaneko, S., Ohta, K., Tanaka, H., Inaka, K., Higuchi, Y., Niimura, N., Samejima, M., and Igarashi, K.
  • Journal Title: Science Adv. Volume : 1 Pages : e1500263
  • DOI: 10.1126/sciadv.1500263
  • Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Real-Time Dynamic adsorption processes of cytochrome c on an electrode observed through electrochemical high-speed atomic force microscopy (2015)
  • Author(s): Takeda, K., Uchihashi, T., Watanabe, H., Ishida, T., Igarashi, K., Nakamura, N., and Ohno, H.
  • Journal Title: PLOS One Volume : 10 Pages : e0116685
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0116685
  • Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] A novel pyrroloquinoline quinone-dependent 2-keto-D-glucose dehydrogenase from Pseudomonas aureofaciens (2015)
  • Author(s): Umezawa, K., Takeda, K., Ishida, T., Sunagawa, N., Makabe, A., Isobe, K., Koba, K., Ohno, H., Samejima, M., Nakamura, N., Igarashi, K., and Yoshida, M.
  • Journal Title: J. Bacteriol. Volume : 197 Pages : 1322-1329
  • DOI: 10.1128/JB.02376-14
  • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Trade-off between processivity and hydrolytic velocity of cellobiohydrolases at the surface of crystalline cellulose (2014)
  • Author(s): Nakamura, A., Watanabe, H., Ishida, T., Uchihashi, T., Wada, M., Ando, T., Igarashi, K., and Samejima, M.
  • Journal Title: J. Amer. Chem. Soc. Volume : 136 Pages : 4584-4592
  • DOI: 10.1021/ja4119994
  • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Single-molecule imaging analysis of elementary reaction steps of Trichoderma reesei cellobiohydrolase I (Cel7A) hydrolyzing crystalline cellulose Iα and III(I) (2014)
  • Author(s): Shibafuji, Y., Nakamura, A., Uchihashi, T., Sugimoto, N., Fukuda, S., Watanabe, H., Samejima, M., Ando, A., Noji, H., Koivula, A., Igarashi, K., and Iino, R.
  • Journal Title: J. Biol. Chem. Volume : 289 Pages : 14056-14065
  • DOI: 10.1074/jbc.M113.546085
  • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] The GH26 β-mannanase RsMan26H from a symbiotic protist of the termite Reticulitermes speratus is an endo-processive mannobiohydrolase: heterologous expression and characterization (2014)
  • Author(s): Tsukagoshi, H., Nakamura, A., Ishida, T., Otagiri, M., Moriya, S., Samejima, M., Igarashi, K., Kitamoto, K., and Arioka, M.
  • Journal Title: Biochem. Biophys. Res. Commun. Volume : 452 Pages : 520-525
  • DOI: 10.1016/j.bbrc.2014.08.103
  • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Structural and biochemical analyses of glycoside hydrolase family 26 β-mannanase from a symbiotic protist of the termite Reticulitermes speratus (2014)
  • Author(s): Tsukagoshi, H., Nakamura, A., Ishida, T., Touhara, K. K., Otagiri, M. Moriya, S., Samejima, M., Igarashi, K., Fushinobu, S., Kitamoto, K., and Arioka M.
  • Journal Title: J. Biol. Chem. Volume : 289 Pages : 10843-10852
  • DOI: 10.1074/jbc.M114.555383
  • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Tryptophan residue at active-site tunnel entrance of Trichoderma reesei cellobiohydrolase Cel7A is important to initiate degradation of crystalline cellulose (2013)
  • Author(s): Nakamura, A., Tsukada, T., Auer, S., Furuta, T., Wada, M., Koivula, A., Igarashi, K., and Samejima, M.
  • Journal Title: J. Biol. Chem. Volume : 288 Pages : 13503-13510
  • DOI: 10.1074/jbc.M113.452623
  • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] High-speed atomic force microscope combined with single-molecule fluorescence microscope (2013)
  • Author(s): Fukuda, S., Uchihashi, T., Iino, R., Okazaki, Y., Yoshida, M., Igarashi, K., and Ando, T.
  • Journal Title: Rev. Sci. Instr. Volume : 84 Pages : 073706
  • DOI: 10.1063/1.4813280
  • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Cellulases: Cooperative biomass breakdown (2013)
  • Author(s): Kiyohiko Igarashi
  • Journal Title: Nature Chem. Biol Volume : 9 Pages : 350-351
  • DOI: 10.1038/nchembio.1237
• [Journal Article] Adsorption characteristics of fungal family 1 cellulose-binding domain from Trichoderma reesei cellobiohydrolase I on crystalline cellulose: Negative cooperative adsorption via a steric exclusion effect (2012)
  • Author(s): Sugimoto, N., Igarashi, K., Wada, M., and Samejima, M.
  • Journal Title: Langmuir Volume : 28 Pages : 14323-14329
  • DOI: 10.1021/la302352k
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Degradation of crystalline celluloses by Phanerochaete chrysosporium cellobiohydrolase II (Cel6A) heterologously expressed in methylotrophic yeast Pichia pastoris (2012)
  • Author(s): Igarashi, K., Maruyama, M., Nakamura, A., Ishida, T., Wada, M., and Samejima, M.
  • Journal Title: J. Appl. Glycosci. Volume : 59 Pages : 105-110
  • DOI: 10.5458/jag.jag.JAG-2011_029
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Cellulose affinity purification of fusion proteins tagged with fungal family 1 cellulose-binding domain (2012)
  • Author(s): Sugimoto, N., Igarashi, K., and Samejima, M.
  • Journal Title: Prot. Expres. Purif. Volume : 82 Pages : 290-296
  • DOI: 10.1016/j.pep.2012.01.007
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Direct electrochemistry of Phanerochaete chrysosporium cellobiose dehydrogenase covalently attached onto gold nanoparticle modified solid gold electrodes (2012)
  • Author(s): Matsumura, H., Ortiz, R., Ludwig, R., Igarashi, K., Samejima, M., and Gorton, L.
  • Journal Title: Langmuir Volume : 28 Pages : 10925-10933
  • DOI: 10.1021/la3018858
  • Peer Reviewed
• [Presentation] 中性子構造解析で可視化するタンパク質本来の姿 ー多重互変異がセルラーゼの活性に与える影響ー (2016)
  • Author(s): 五十嵐圭日子
  • Organizer: 2015年度量子サイエンスフェスタ
  • Place of Presentation: つくば国際会議場，茨城県
  • Year and Date: 2016-03-15 – 2016-03-16
  • Invited
• [Presentation] Pichia pastoris を用いたセルロース合成酵素発現系の構築 (2015)
  • Author(s): 砂川 直輝、鮫島 正浩、五十嵐 圭日子、田島 健次
  • Organizer: セルロース学会第22回年次大会
  • Place of Presentation: 北海道大学 学術交流会館、北海道
  • Year and Date: 2015-07-09 – 2015-07-10
• [Presentation] 中性子構造で明らかになる立体反転型セルラーゼの反応機構 (2015)
  • Author(s): 五十嵐圭日子
  • Organizer: 第15回蛋白質科学会
  • Place of Presentation: あわぎんホール、徳島県
  • Year and Date: 2015-06-24 – 2015-06-26
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] Neutron and high-resolution X-ray structural studies of glycoside hydrolase family 45 endoglucanase from the basidiomycete Phanerochaete chrysosporium (2015)
  • Author(s): Nakamura, A., Ishida, T., Samejima, M., and Igarashi K.
  • Organizer: 11th Carbohydrate Bioengineering Meeting
  • Place of Presentation: Aalto University、フィンランド
  • Year and Date: 2015-05-10 – 2015-05-13
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Functional expression of cellulose synthase in Pichia pastoris (2015)
  • Author(s): Sunagawa, N.
  • Organizer: OIST Mini Symposium "Unraveling the mysteries of cellulose: From biosynthesis & biological diversity to biomaterials"
  • Place of Presentation: Okinawa Institute of Science and Technology、沖縄県
  • Year and Date: 2015-04-21 – 2015-04-22
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] セルラーゼとキチナーゼの反応解析：一分子観察と中性子構造解析 (2015)
  • Author(s): 五十嵐圭日子
  • Organizer: 日本化学会第95春季年会アドバンスドテクノロジープログラム（ATP）
  • Place of Presentation: 日本大学 理工学部船橋キャンパス 千葉
  • Year and Date: 2015-03-26 – 2015-03-29
  • Invited
• [Presentation] Single molecular observations of cellulases for cellulose biorefinery (2014)
  • Author(s): Kiyohiko Igarashi
  • Organizer: Danish-Japanese Workshop on Bioenergy
  • Place of Presentation: First Grand Hotel Odense, Denmark
  • Year and Date: 2014-09-11 – 2014-09-11
  • Invited
• [Presentation] 地表最大の資源セルロース系バイオマスを小さな酵素で変換する (2014)
  • Author(s): 五十嵐圭日子
  • Organizer: 新化学技術推進協会（JACI）エネルギー・資源技術部会 バイオマス分科会講演会
  • Place of Presentation: 新化学技術推進協会 東京
  • Year and Date: 2014-08-26 – 2014-08-26
  • Invited
• [Presentation] Genomic and transcriptomic analysis of wood-rotting fungi for the utilization of cellulosic biomass: searching for good enzymes (2014)
  • Author(s): Kiyohiko Igarashi
  • Organizer: The 10th International Mycological Congress
  • Place of Presentation: The Queen Sirikit National Convention Center, Thailand
  • Year and Date: 2014-08-03 – 2014-08-08
  • Invited
• [Presentation] セルロース系バイオマスを分解する酵素の構造機能相関 (2014)
  • Author(s): 五十嵐圭日子
  • Organizer: 学術振興会第169委員会 第45回研究会
  • Place of Presentation: ゆうぽうと 東京
  • Year and Date: 2014-07-25 – 2014-07-25
  • Invited
• [Presentation] Cellulases: cooperative biomass breakdown (2014)
  • Author(s): Kiyohiko Igarashi
  • Organizer: JST-ALCA international workshop Plant Cell Wall Engineering
  • Place of Presentation: 東京農工大学小金井キャンパス 東京
  • Year and Date: 2014-03-04 – 2014-03-04
  • Invited
• [Presentation] Fungal transcriptome as database for proteome and refinement tool of gene annotation (2013)
  • Author(s): Kiyohiko Igarashi
  • Organizer: 2013 Fungal Genetics Conference
  • Place of Presentation: Asilomar Conference Grounds, Pacific Grove、カリフォルニア州、米国
  • Year and Date: 20130312-20130317
  • Invited
• [Presentation] 微生物におけるセルロースとキチンの酵素分解戦略：結晶性構造多糖を利用するためのヒント (2013)
  • Author(s): 五十嵐圭日子
  • Organizer: 第7回多糖の未来フォーラム
  • Place of Presentation: 大阪府立大学 I-siteなんば 大阪
  • Year and Date: 2013-11-01 – 2013-11-01
  • Invited
• [Presentation] プロセッシブグリコシダーゼはどうやって結晶性多糖の上を走るのか？ (2013)
  • Author(s): 五十嵐圭日子
  • Organizer: 第3回分子モーター討論会
  • Place of Presentation: 東京大学農学部 中島董一郎記念ホール 東京
  • Year and Date: 2013-07-19 – 2013-07-20
  • Invited
• [Presentation] 結晶性セルロース分解酵素の動的解析とセルロース系バイオマス変換の高効率化 (2013)
  • Author(s): 五十嵐圭日子
  • Organizer: 平成25年度糸状菌遺伝子研究会第34回例会
  • Place of Presentation: 北とぴあ第一研修室 東京
  • Year and Date: 2013-06-21 – 2013-06-21
  • Invited
• [Presentation] Single molecular observations of processive cellulases and chitinases for for effective degradation of crystalline structural polysaccharides (2012)
  • Author(s): Kiyohiko Igarashi
  • Organizer: Frontiers in Protein Science 8th Workshop in Protein
  • Place of Presentation: Denmark Technical University、デンマーク
  • Year and Date: 20121101-20121101
  • Invited
• [Presentation] Fungal transcriptome as a tool to search for biomass-converting enzymes (2012)
  • Author(s): Kiyohiko Igarashi
  • Organizer: Lignobiotech II Symposium
  • Place of Presentation: ACROS Fukuoka、福岡
  • Year and Date: 20121016-20121016
  • Invited
• [Presentation] そろそろ分子を見ませんか？木質細胞壁研究における一分子可視化技術の可能性 (2012)
  • Author(s): 五十嵐圭日子
  • Organizer: 23. 日本木材学会組織と材質研究会2012秋期シンポジウム
  • Place of Presentation: 東京農工大学農学部府中キャンパス、東京
  • Year and Date: 20120926-20120926
  • Invited
• [Remarks] 五十嵐圭日子准教授らのグループの研究成果が、ギネス世界記録™に認定されました
  • URL: http://www.u-tokyo.ac.jp/ja/news/topics/topics_z0107_00008.html
• [Remarks] セルラーゼは「かちかち玉」のような反応機構だった
  • URL: http://www.u-tokyo.ac.jp/ja/utokyo-research/research-news/newtons-cradle-proton-relay-in-cellulase.html
• [Remarks] 中性子回折法によってタンパク質の多彩さ・巧妙さを可視化することに成功
  • URL: http://www.a.u-tokyo.ac.jp/topics/2015/20150824-1.html
• [Remarks] 結晶性セルロースの分解は、切断の「速さ」ではなく基質を掴み続ける「ねばり強さ」が重要である
  • URL: http://www.a.u-tokyo.ac.jp/topics/2014/20140313-4.html
• [Remarks] 糸状菌由来セルラーゼがセルロース分子鎖の末端を認識する機構の解明
  • URL: http://www.a.u-tokyo.ac.jp/topics/2013/20130510-2.html
• [Remarks] やはりカメはウサギに勝る
  • URL: http://www.u-tokyo.ac.jp/ja/utokyo-research/research-news/the-tortoise-beats-the-hare-again/
• [Remarks] シロアリ腸内に共生する原生生物由来の新規なマンナン分解酵素の立体構造を解明
  • URL: http://www.a.u-tokyo.ac.jp/topics/2014/20140417-1.html