植物細胞壁合成酵素および分解酵素を用いた細胞外情報処理空間の動的可視化

• Project Area: Plant cell wall as information-processing system
• Project/Area Number: 24114008
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Research in a proposed research area)
• Research Institution: The University of Tokyo
• Principal Investigator: 五十嵐 圭日子 東京大学, 大学院農学生命科学研究科(農学部), 准教授 (80345181)
• Project Fiscal Year: 2012-06-28 – 2017-03-31
• Project Status: Granted(Fiscal Year 2016)
• Budget Amount: ¥59,150,000 (Direct Cost : ¥45,500,000、Indirect Cost : ¥13,650,000); Fiscal Year 2016 : ¥13,130,000 (Direct Cost : ¥10,100,000、Indirect Cost : ¥3,030,000); Fiscal Year 2015 : ¥13,130,000 (Direct Cost : ¥10,100,000、Indirect Cost : ¥3,030,000); Fiscal Year 2014 : ¥13,130,000 (Direct Cost : ¥10,100,000、Indirect Cost : ¥3,030,000); Fiscal Year 2013 : ¥13,000,000 (Direct Cost : ¥10,000,000、Indirect Cost : ¥3,000,000); Fiscal Year 2012 : ¥6,760,000 (Direct Cost : ¥5,200,000、Indirect Cost : ¥1,560,000)
• Keywords: 植物細胞壁 / バイオマス / セルロース / セルロース分解酵素 / セルロース合成酵素 / 一分子可視化技術

Outline of Annual Research Achievements

植物細胞壁の主成分である結晶性セルロースが，セルラーゼによってどのように分解されるのかを明らかにするために，高速原子間力顕微鏡（HS-AFM）および全反射蛍光顕微鏡（TIRFM）を用いて観察を行った。これら一分子観察によって植物細胞壁のような固体表面で分解酵素はどのように振る舞うのかを明らかにし，植物細胞壁と分解酵素を動的に可視化することに成功した。
結晶性セルロース表面に吸着した酵素の滞在時間を測定し，その頻度分布のヒストグラムを解析したところ，二重指数関数で近似されることが明らかとなった。本結果は米国生化学会誌（J. Biol. Chem.）に受理された。また，連続的（プロセッシブ）な加水分解速度が異なると考えられる3つのセロビオヒドロラーゼ（TrCel7A，PcCel7C，PcCel7D）の加水分解速度と解離定数の関係を明らかにするために，高速原子間力顕微鏡によって三つの酵素の挙動を明らかにした。その結果加水分解速度と表面からの解離にはトレードオフの関係が成り立つことが分かった。本結果は米国化学会誌（J. Amer. Chem. Soc.）に受理された。
さらに、セルロース生合成酵素（GxCeSAB）の異宿主発現系の構築を試み，メタノール資化性酵母を用いた発現系の構築に成功した。GxCeSABによるin vitroセルロース合成反応の結果，白色の水不溶性物質の生成が確認された。生成物をTricoderma reesei由来のセルラーゼ（TrCel7A）によって分解した結果，白色の水不溶性物質は完全に無くなり，分解物としてグルコースとセロビオースが生じることを確認した。以上の結果は，Pichia酵母を用いたセルロース合成酵素の生産に成功し，さらにin vitroでのセルロース合成に成功したことを示しており，投稿に向けて準備中である。

Current Status of Research Progress

Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

セルラーゼを用いた植物細胞壁分解プロセスの可視化に関しては、予想以上の進展を見せており、いくつもの公表論文となっている点は当初の計画以上であると思われるが、その一方でセルロース合成酵素の発現に関しては、異宿主（Pichia pastoris）を用いた発現系の構築までは予想以上の進度であったが、発現タンパク質量の生産性が分解酵素と比較して極端に低く、そのために今年度の進展は年度初めに考えたいたほどではなかった。昨年度の進展を含めると全体としては遅れていないことから「おおむね順調に進展している」との評価をした。

Research Output

• [Journal Article] Structural and biochemical analyses of glycoside hydrolase family 26 β-mannanase from a symbiotic protist of the termite Reticulitermes speratus (2014)
  • Author(s): Tsukagoshi, H., Nakamura, A., Ishida, T., Touhara, K. K., Otagiri, M. Moriya, S., Samejima, M., Igarashi, K., Fushinobu, S., Kitamoto, K., and Arioka M.
  • Journal Title: J. Biol. Chem. Volume : 289 Pages : 10843-10852
  • DOI: 10.1074/jbc.M114.555383
• [Journal Article] Trade-off between processivity and hydrolytic velocity of cellobiohydrolases at the surface of crystalline cellulose (2014)
  • Author(s): Nakamura, A., Watanabe, H., Ishida, T., Uchihashi, T., Wada, M., Ando, T., Igarashi, K., and Samejima, M.
  • Journal Title: J. Amer. Chem. Soc. Volume : 136 Pages : 4584-4592
  • DOI: 10.1021/ja4119994
• [Journal Article] Single-molecule imaging analysis of elementary reaction steps of Trichoderma reesei cellobiohydrolase I (Cel7A) hydrolyzing crystalline cellulose Iα and III(I) (2014)
  • Author(s): Shibafuji, Y., Nakamura, A., Uchihashi, T., Sugimoto, N., Fukuda, S., Watanabe, H., Samejima, M., Ando, A., Noji, H., Koivula, A., Igarashi, K., and Iino, R.
  • Journal Title: J. Biol. Chem. Volume : 289 Pages : 14056-14065
  • DOI: 10.1074/jbc.M113.546085
• [Journal Article] The GH26 β-mannanase RsMan26H from a symbiotic protist of the termite Reticulitermes speratus is an endo-processive mannobiohydrolase: heterologous expression and characterization (2014)
  • Author(s): Tsukagoshi, H., Nakamura, A., Ishida, T., Otagiri, M., Moriya, S., Samejima, M., Igarashi, K., Kitamoto, K., and Arioka, M.
  • Journal Title: Biochem. Biophys. Res. Commun. Volume : 452 Pages : 520-525
  • DOI: 10.1016/j.bbrc.2014.08.103
• [Journal Article] Tryptophan residue at active-site tunnel entrance of Trichoderma reesei cellobiohydrolase Cel7A is important to initiate degradation of crystalline cellulose (2013)
  • Author(s): Nakamura, A., Tsukada, T., Auer, S., Furuta, T., Wada, M., Koivula, A., Igarashi, K., and Samejima, M.
  • Journal Title: J. Biol. Chem. Volume : 288 Pages : 13503-13510
  • DOI: 10.1074/jbc.M113.452623
• [Journal Article] High-speed atomic force microscope combined with single-molecule fluorescence microscope (2013)
  • Author(s): Fukuda, S., Uchihashi, T., Iino, R., Okazaki, Y., Yoshida, M., Igarashi, K., and Ando, T.
  • Journal Title: Rev. Sci. Instr. Volume : 84 Pages : 073706
  • DOI: 10.1063/1.4813280
• [Journal Article] Cellulases: Cooperative biomass breakdown (2013)
  • Author(s): Kiyohiko Igarashi
  • Journal Title: Nature Chem. Biol Volume : 9 Pages : 350-351
  • DOI: 10.1038/nchembio.1237
• [Journal Article] Adsorption characteristics of fungal family 1 cellulose-binding domain from Trichoderma reesei cellobiohydrolase I on crystalline cellulose: Negative cooperative adsorption via a steric exclusion effect (2012)
  • Author(s): Sugimoto, N., Igarashi, K., Wada, M., and Samejima, M.
  • Journal Title: Langmuir Volume : 28 Pages : 14323-14329
  • DOI: 10.1021/la302352k
• [Journal Article] Degradation of crystalline celluloses by Phanerochaete chrysosporium cellobiohydrolase II (Cel6A) heterologously expressed in methylotrophic yeast Pichia pastoris (2012)
  • Author(s): Igarashi, K., Maruyama, M., Nakamura, A., Ishida, T., Wada, M., and Samejima, M.
  • Journal Title: J. Appl. Glycosci. Volume : 59 Pages : 105-110
  • DOI: 10.5458/jag.jag.JAG-2011_029
• [Journal Article] Cellulose affinity purification of fusion proteins tagged with fungal family 1 cellulose-binding domain (2012)
  • Author(s): Sugimoto, N., Igarashi, K., and Samejima, M.
  • Journal Title: Prot. Expres. Purif. Volume : 82 Pages : 290-296
  • DOI: 10.1016/j.pep.2012.01.007
• [Journal Article] Direct electrochemistry of Phanerochaete chrysosporium cellobiose dehydrogenase covalently attached onto gold nanoparticle modified solid gold electrodes (2012)
  • Author(s): Matsumura, H., Ortiz, R., Ludwig, R., Igarashi, K., Samejima, M., and Gorton, L.
  • Journal Title: Langmuir Volume : 28 Pages : 10925-10933
  • DOI: 10.1021/la3018858
• [Presentation] セルラーゼとキチナーゼの反応解析：一分子観察と中性子構造解析 (2015)
  • Author(s): 五十嵐圭日子
  • Organizer: 日本化学会第95春季年会アドバンスドテクノロジープログラム（ATP）
  • Place of Presentation: 日本大学 理工学部船橋キャンパス 千葉
  • Year and Date: 2015-03-26 – 2015-03-29
• [Presentation] Single molecular observations of cellulases for cellulose biorefinery (2014)
  • Author(s): Kiyohiko Igarashi
  • Organizer: Danish-Japanese Workshop on Bioenergy
  • Place of Presentation: First Grand Hotel Odense, Denmark
  • Year and Date: 2014-09-11 – 2014-09-11
• [Presentation] 地表最大の資源セルロース系バイオマスを小さな酵素で変換する (2014)
  • Author(s): 五十嵐圭日子
  • Organizer: 新化学技術推進協会（JACI）エネルギー・資源技術部会 バイオマス分科会講演会
  • Place of Presentation: 新化学技術推進協会 東京
  • Year and Date: 2014-08-26 – 2014-08-26
• [Presentation] Genomic and transcriptomic analysis of wood-rotting fungi for the utilization of cellulosic biomass: searching for good enzymes (2014)
  • Author(s): Kiyohiko Igarashi
  • Organizer: The 10th International Mycological Congress
  • Place of Presentation: The Queen Sirikit National Convention Center, Thailand
  • Year and Date: 2014-08-03 – 2014-08-08
• [Presentation] セルロース系バイオマスを分解する酵素の構造機能相関 (2014)
  • Author(s): 五十嵐圭日子
  • Organizer: 学術振興会第169委員会 第45回研究会
  • Place of Presentation: ゆうぽうと 東京
  • Year and Date: 2014-07-25 – 2014-07-25
• [Presentation] Cellulases: cooperative biomass breakdown (2014)
  • Author(s): Kiyohiko Igarashi
  • Organizer: JST-ALCA international workshop Plant Cell Wall Engineering
  • Place of Presentation: 東京農工大学小金井キャンパス 東京
  • Year and Date: 2014-03-04 – 2014-03-04
• [Presentation] Fungal transcriptome as database for proteome and refinement tool of gene annotation (2013)
  • Author(s): Kiyohiko Igarashi
  • Organizer: 2013 Fungal Genetics Conference
  • Place of Presentation: Asilomar Conference Grounds, Pacific Grove、カリフォルニア州、米国
  • Year and Date: 20130312-20130317
• [Presentation] 微生物におけるセルロースとキチンの酵素分解戦略：結晶性構造多糖を利用するためのヒント (2013)
  • Author(s): 五十嵐圭日子
  • Organizer: 第7回多糖の未来フォーラム
  • Place of Presentation: 大阪府立大学 I-siteなんば 大阪
  • Year and Date: 2013-11-01 – 2013-11-01
• [Presentation] プロセッシブグリコシダーゼはどうやって結晶性多糖の上を走るのか？ (2013)
  • Author(s): 五十嵐圭日子
  • Organizer: 第3回分子モーター討論会
  • Place of Presentation: 東京大学農学部 中島董一郎記念ホール 東京
  • Year and Date: 2013-07-19 – 2013-07-20
• [Presentation] 結晶性セルロース分解酵素の動的解析とセルロース系バイオマス変換の高効率化 (2013)
  • Author(s): 五十嵐圭日子
  • Organizer: 平成25年度糸状菌遺伝子研究会第34回例会
  • Place of Presentation: 北とぴあ第一研修室 東京
  • Year and Date: 2013-06-21 – 2013-06-21
• [Presentation] Single molecular observations of processive cellulases and chitinases for for effective degradation of crystalline structural polysaccharides (2012)
  • Author(s): Kiyohiko Igarashi
  • Organizer: Frontiers in Protein Science 8th Workshop in Protein
  • Place of Presentation: Denmark Technical University、デンマーク
  • Year and Date: 20121101-20121101
• [Presentation] Fungal transcriptome as a tool to search for biomass-converting enzymes (2012)
  • Author(s): Kiyohiko Igarashi
  • Organizer: Lignobiotech II Symposium
  • Place of Presentation: ACROS Fukuoka、福岡
  • Year and Date: 20121016-20121016
• [Presentation] そろそろ分子を見ませんか？木質細胞壁研究における一分子可視化技術の可能性 (2012)
  • Author(s): 五十嵐圭日子
  • Organizer: 23. 日本木材学会組織と材質研究会2012秋期シンポジウム
  • Place of Presentation: 東京農工大学農学部府中キャンパス、東京
  • Year and Date: 20120926-20120926
• [Remarks] 糸状菌由来セルラーゼがセルロース分子鎖の末端を認識する機構の解明
  • URL: http://www.a.u-tokyo.ac.jp/topics/2013/20130510-2.html
• [Remarks] 結晶性セルロースの分解は、切断の「速さ」ではなく基質を掴み続ける「ねばり強さ」が重要である
  • URL: http://www.a.u-tokyo.ac.jp/topics/2014/20140313-4.html
• [Remarks] やはりカメはウサギに勝る
  • URL: http://www.u-tokyo.ac.jp/ja/utokyo-research/research-news/the-tortoise-beats-the-hare-again/
• [Remarks] シロアリ腸内に共生する原生生物由来の新規なマンナン分解酵素の立体構造を解明
  • URL: http://www.a.u-tokyo.ac.jp/topics/2014/20140417-1.html
• [Remarks] 結晶性セルロースの分解は、切断の「速さ」ではなく基質を掴み続ける「ねばり強さ」が重要である
  • URL: http://www.a.u-tokyo.ac.jp/topics/2014/20140313-4.html