酵母の細胞表層工学によるコンビナトリアル生体媒体の構築

• Project/Area Number: 00F00137
• Research Category: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• Allocation Type: Single-year Grants
• Section: 外国
• Research Field: 生物・生体工学
• Research Institution: Kyoto University
• Principal Investigator: 植田 充美 (2002) 京都大学, 工学研究科, 助教授; 田中 渥夫 (2001)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): SHI Yi?Feng 京都大学, 工学研究科, 外国人特別研究員 ; SHI Y.
• Project Period (FY): 2001 – 2002
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2002)
• Budget Amount: ¥2,200,000 (Direct Cost: ¥2,200,000); Fiscal Year 2002: ¥1,000,000 (Direct Cost: ¥1,000,000); Fiscal Year 2001: ¥1,200,000 (Direct Cost: ¥1,200,000)
• Keywords: ファージ / 酵母 / 細胞表層工学 / ライブラリー / ディスプレイ / リパーゼ / ペニシリンアシラーゼ / インテイン

Research Abstract

ファージや酵母などの細胞表層に、遺伝子工学の手法を用いて、ランダムな配列をもつコンビナトリアルなタンパク質分子を提示したライブラリーを作製する。このタンパク質ライブラリーを目的とする基質をプローブにしてスクリーニングし、この基質を認識したり、この基質を変換する触媒能を有するタンパク質分子を選択する。さらに、得られたタンパク質分子のアミノ酸配列を基にして、これまでにない触媒活性をもつ分子を創出する。これらを目的に、まず、ファージディスプレイ系を立ち上げることを優先させた。
そこで、ファージディスプレイシステムを、タンパク質サブユニットのフォールデイングによるヘテロダイマー化で活性を発揮するペニシリンアシラーゼに適用し、この酵素をファージ表層に活性をもって提示に成功した。そこでさらに、サブユニット間でペプチドスプライシング可能なインテイン分子を挿入した遺伝子構築も行なって、このペニシリンアシラーゼについて、活性部位ならびに、サブユニット相互作用部位、さらに、立体構造維持のための部位の同定と改変を行なった結果、目的の活性を評価できるクローンを獲得できた。また、これまで世界で成功例のないリパーゼのファージディスプレイに成功をおさめたので、これらの結果をふまえて、実験系としての酵母細胞表層ディスプレイ系とファージディスプレイ系の相互比較を行なった。