細胞死にともなう細胞死抑制因子(Bcl-2)の動態に関する研究

• Project/Area Number: 00J01327
• Research Category: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• Allocation Type: Single-year Grants
• Section: 国内
• Research Field: Conservative dentistry
• Research Institution: Osaka University
• Principal Investigator: 金森 市朗 大阪大学, 歯学研究科, 特別研究員(PD)
• Project Period (FY): 2000 – 2002
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2002)
• Budget Amount: ¥3,600,000 (Direct Cost: ¥3,600,000); Fiscal Year 2002: ¥1,200,000 (Direct Cost: ¥1,200,000); Fiscal Year 2001: ¥1,200,000 (Direct Cost: ¥1,200,000); Fiscal Year 2000: ¥1,200,000 (Direct Cost: ¥1,200,000)
• Keywords: アポトーシス / Bcl-2 / チトクロームc / ミトコンドリア / PC12細胞 / HeLa細胞

Research Abstract

平成12年度に採取したヒトbcl-2-GFP遺伝子導入PC12細胞と同遺伝子導入HeLa細胞を免疫組織化学的手法を用いて、観察検討した。すなわち、通常状態で培養したヒトbcl-2-GFP遺伝子導入PC12細胞と同遺伝子導入HeLa細胞、また、細胞死を誘導した後の同細胞(PC12細胞は血清除去24時間後、HeLa細胞はTNF-αにて細胞死を誘導した)を0.1%グルタールアルデヒドならびに4%パラホルムアルデヒド(0.1MPB緩衝液)で固定し、凍結薄切切片を作製し、抗GFP抗体、抗Bcl-2抗体を用いて、免疫染色を施し、電子顕微鏡にて観察を行なった。その結果、通常状態で培養したヒトbcl-2-GFP遺伝子導入PC12細胞と同遺伝子導入HeLa細胞では、いずれの細胞でもBcl-2はミトコンドリアの内外膜、特に内膜に局在し、その他、核膜や小胞体と思われる構造物にも局在していた。一方、細胞死を誘導されたヒトbcl-2-GFP遺伝子導入PC12細胞と同遺伝子導入HeLa細胞では、Bcl-2の局在に変化が起こり、Bcl-2はミトコンドリアの内膜から、ほとんどが消え、ミトコンドリアの周囲に観察された。
また、Bcl-2をtime-lapse microscopeで経時的に観察したところ、Bcl-2は顆粒状であった。細胞死を誘導したところ、顆粒状だったBcl-2は細胞質に拡散するように観察された。それぞれの細胞を固定し、免疫染色したところ、チトクロームcは細胞死誘導前はミトコンドリアに局在し、細胞死誘導後は細胞質に流出した。
これらのことから、Bcl-2がミトコンドリアから細胞質に移行した後に、チトクロームcがミトコンドリアから流出することが強く示唆された。

Research Products

• [Publications] Kametaka, S et al.: "Identification of phospholipid scramblase 1 as a novel interacting molecule with beta -secretase (BACE)"J Biol Chem. (in press). (2003)