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1分子計測によるRho family small GTPaseの機能解析

Research Project

Project/Area Number 00J01990
Research Category

Grant-in-Aid for JSPS Fellows

Allocation TypeSingle-year Grants
Section国内
Research Field Cell biology
Research InstitutionOsaka University
Research Fellow 宮内 崇行  大阪大学, 医学系研究科, 特別研究員(DC1)
Project Period (FY) 2000 – 2002
Project Status Completed (Fiscal Year 2002)
Budget Amount *help
¥3,000,000 (Direct Cost: ¥3,000,000)
Fiscal Year 2002: ¥1,000,000 (Direct Cost: ¥1,000,000)
Fiscal Year 2001: ¥1,000,000 (Direct Cost: ¥1,000,000)
Fiscal Year 2000: ¥1,000,000 (Direct Cost: ¥1,000,000)
Keywords1分子計測 / small GTPase / Rho / FRET / 蛍光共鳴エネルギー移動
Research Abstract

低分子量GTP結合蛋白質であるRhoファミリーsmall GTPaseは,Rho, Rac, Cdc42などから構成され,主にアクチン系の細胞骨格を介して,細胞の形態や細胞間接着など様々な細胞機能を制御する.よってRhoファミリー分子の「局所的な」活性化の検出を可能にすることは,細胞生物学における重要課題の1つであると考えられていた。
申請者は,細胞内1分子計測技術を利用し,「蛍光ラベルしたGTP」と,「Rhoファミリー分子と蛍光蛋白質との融合蛋白質(Rho::GFP)」との間で発生する蛍光エネルギー移動を細胞内で検出することによって,上記の局所的な活性化の可視化を実現した。
まずin vitroにおいて,GFP融合Rho GTPases(RhoA, Rac1,そしてCdc42)と蛍光標識GTPとの間でFRETが生ずることを見出し,このFRETがRho GTPasesの活性化を反映していることを,GTPによる競合阻害実験,そして結合実験などにより確認した。
YFP融合Rho GTPaseを発現させた培養細胞に,蛍光標識GTを導入し,細胞外刺激を加えたところ,細胞内局所的にFRETの蛍光が観察された。例えば基底膜近傍のGFP-RhoAの場合,LPA受容体刺激後30秒以内から,接着斑と考えられる領域で活性化が進行した。Rac/Cdc42は伸長する神経突起様構造の先端部で活性化が進行し,突起の形態形成と密接な関係があることを見出した。
膜蛋白質CD44の切断は,癌細胞の浸潤転移を密接な関与が推定されているが,この切断をRac1の局所的な活性化が制御していることを上記の可視化法で示した。

Report

(1 results)
  • 2002 Annual Research Report

Research Products

(1 results)

All Other

All Publications (1 results)

  • [Publications] 宮内崇行, 日比野佳代, 佐甲靖志: "蛍光共鳴エネルギー移動のイメージング"バイオサイエンス新世紀. 12. 210-217 (2002)

    • Related Report
      2002 Annual Research Report

URL: 

Published: 2000-03-31   Modified: 2016-04-21  

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