特異的DNA配列固定化磁性細菌粒子を用いた自動同定装置の構築及び、その工学的応用

• Project/Area Number: 00J04770
• Research Category: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• Allocation Type: Single-year Grants
• Section: 国内
• Research Field: 生物・生体工学
• Research Institution: Tokyo University of Agriculture and Technology
• Principal Investigator: 中山 秀喜 東京農工大学, 工学部, 特別研究員(PD)
• Project Period (FY): 2000 – 2002
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2002)
• Budget Amount: ¥3,900,000 (Direct Cost: ¥3,900,000); Fiscal Year 2002: ¥1,200,000 (Direct Cost: ¥1,200,000); Fiscal Year 2001: ¥1,200,000 (Direct Cost: ¥1,200,000); Fiscal Year 2000: ¥1,500,000 (Direct Cost: ¥1,500,000)
• Keywords: ハイブリダイゼーション / 蛍光検出 / 塩基差異 / DNA検出 / FRET

Research Abstract

これまでに磁性細菌が生産するバイオナノ磁性粒子(Bacterial Magnetic Particle ; BMP)をDNAの固定化担体とし、蛍光共鳴エネルギー転移(FRET)を用いることにより、アルデヒドデヒドロゲナーゼ2遺伝子の一塩基多型の識別が可能であることを示してきた。ここではGC含量が76%と高い、骨粗鬆症関連遺伝子TGF-β1の一塩基多型の識別を試みた。
ビオチン標識架橋剤(Sulfo-LC-LC-biotin)を用いてBMP上にストレプトアビジンを導入し、ストレプトアビジン固定化粒子(SA-BMP)を作製した。一方、血液より抽出したDNAをテンプレートとし、ビオチン標識プライマーを用いてPCRによりTGF-β1遺伝子の増幅断片(139bp)を調製した。正常サンプルをTGF-β1*1型とし、1塩基変異を含む不活性型サンプルをTGF-β1*2型とした。得られたビオチン標識PCR産物をSA-BMPを用いて回収し、磁気分離により未回収のPCR産物の除去を行った。その後FITC標識された各検出プローブ10pmolと、DNAインターカレータPOPO-3(1μM)を加えて、熱変成5分、ハイブリダイゼーション10分を行った。反応槽の底面にて磁気分離をした後、上清の蛍光強度(Ex./Em.=490/570nm)の測定を行った。
PCR bufferに15%グリセロールを加えることでTGF-β1遺伝子の増幅は認められたが、その増幅された断片に対して、FRETによるSNPの検出を行ったところFRETに由来する蛍光が得られなかった。これはターゲットDNAのGC含量が高いため、熱変性による一本鎖DNAの調製が困難であることが考えらえた。そこで検出時に用いるBufferに対してPCRと同様に15%グリセロールを加えて検出を行った結果、FRETに由来する弱いシグナルが検出された。これはターゲットDNAにハイブリダイズしている検出プローブの量が少ないために、得られる蛍光強度が低いと考えられた。さらに検出プローブとのハイブリダイゼーション時に用いるbufferについて検討を行った結果、15%グリセロールを含む検出bufferに8% DMSO、4% Formamideを加えることで、FRETに由来する蛍光強度の増加が示された。

Research Products

• [Publications] H.Ota, H.Takeyama, H.Nakayama, T.Katoh, T.Matsunaga: "SNP Detection in Transforming Growth Factor-β1 Gene Using Bacterial Magnetic Particles"Biosens Bioelectron. (in press).