必須因子のみからなる生体外タンパク質合成系の構築

Research Project

Project/Area Number	00J09562
Research Category	Grant-in-Aid for JSPS Fellows
Allocation Type	Single-year Grants
Section	国内
Research Field	生物・生体工学
Research Institution	The University of Tokyo
Principal Investigator	清水義宏東京大学, 大学院・新領域創成科学研究科, 特別研究員(DC1)
Project Period (FY)	2000 – 2002
Project Status	Completed (Fiscal Year 2002)
Budget Amount *help	¥3,000,000 (Direct Cost: ¥3,000,000) Fiscal Year 2002: ¥1,000,000 (Direct Cost: ¥1,000,000) Fiscal Year 2001: ¥1,000,000 (Direct Cost: ¥1,000,000) Fiscal Year 2000: ¥1,000,000 (Direct Cost: ¥1,000,000)
Keywords	生体外タンパク質合成系 / 翻訳 / 大腸菌 / tmRNA / ssrA / trans-translation / SmpB / EF-Tu
Research Abstract	前年に引き続き必須因子のみからなる生体外タンパク質合成系(PUREシステム)を用いてtmRNAというRNA分子が引き起こすトランストランスレーションのメカニズムの解明を行った。トランスレーション反応には機能未知なSmpBというタンパク質が関与しており、前年までの研究成果によりこのタンパク質が、tmRNAのアミノアシル化の効率を促進している、アラニルtmRNAがリボソームのエントリーに不可欠であるという二つの機能を有しているという結果を得た。通常の翻訳系において、アミノアシルtRNAのリボソームへのエントリーにはEF-Tuという翻訳因子がその役割を果たしているということが知られているがアラニルtmRNAのリボソームエントリーに関してはこのEF-Tuが関与しているという直接的な証拠は得られていない。そこで、終止コドンを欠いたジヒドロ葉酸還元酵素をコードするmRNAを調製し、これを翻訳させた後、終止コドンの手前で翻訳が止まってしまった複合体を超遠心によって調製し、これに対し、EF-Tuの存在下、非存在下、そしてEF-Tuの機能を阻害することが知られている抗生物質キロマイシンの存在下においてそれぞれアラニルtmRNAがリボソームにエントリーするかどうかを観察した。その結果いずれの反応系においても同程度にアラニルtmRNAがリボソームにエントリーするという結果が得られ、アラニルtmRNAのリボソームエントリーにはEF-Tuが必要でないことが明らかになった。さらに、クロスリンキングの実験によってEF-Tuが通常のアラニルtmRNAには結合することが可能であるが、SmpBの存在下においてはEF-Tuがもはや結合しないという結果が得られ、SmpBがEF-Tuの結合を阻害しているという事が明らかとなった。