顕微鏡視野内におけるSV40複製反応の直接観察法を用いた分子動態の解明
| Project/Area Number |
00J10638
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| Research Category |
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Section | 国内 |
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| Research Field |
Molecular biology
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| Research Institution | Toyohashi University of Technology |
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Principal Investigator |
松浦 俊一 豊橋技術科学大学, 工学研究科, 特別研究員(DC1)
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| Project Period (FY) |
2000 – 2002
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| Project Status |
Completed (Fiscal Year 2002)
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| Budget Amount *help |
¥3,000,000 (Direct Cost: ¥3,000,000)
Fiscal Year 2002: ¥1,000,000 (Direct Cost: ¥1,000,000)
Fiscal Year 2001: ¥1,000,000 (Direct Cost: ¥1,000,000)
Fiscal Year 2000: ¥1,000,000 (Direct Cost: ¥1,000,000)
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| Keywords | DNA / DNA1分子マニピュレーション / DNA-酵素間相互作用 / 蛍光顕微鏡 / DNAポリメラーゼβ / 蛍光標識 / 疎水性ガラス基板 / 直流電界 |
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| Research Abstract |
●固定化DNA形態制御技術のDNAポリメラーゼ動態解析への応用
本研究では、これまでに開発した技術のうち、(1)疎水性ガラス基板へのDNA分子の片端固定、(2)直流電場によるDNAの形態制御、また(3)酵素活性を保持できる酵素分子の蛍光標識法を真核細胞のDNAポリメラーゼβの動態解析に応用した。DNAポリメラーゼβの蛍光標識では、DNAと複合体を形成した状態で酵素表面のアミノ基に蛍光物質を結合させることによって、酵素活性を保持したまま標識産物を回収することに成功した。蛍光標識DNAポリメラーゼβの比活性が標識前のDNAポリメラーゼに比べて増大したことは、標識過程においてDNA結合活性を有しているDNAポリメラーゼのみが選択的に回収できていることを示唆している。また、標識産物をSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動で解析した結果、標識前のDNAポリメラーゼβと比較してバンドがシフトアップしたことからDNAポリメラーゼβに蛍光物質が共有結合していることが示された。顕微鏡視野内においてガラス基板に静電的に伸張固定した2本鎖DNAにdNTPとマグネシウムイオンが存在しない条件で蛍光標識DNAポリメラーゼβを作用させたところ、DNA上に結合する様子がみられ、またDNA鎖に沿って直線的にスライディング運動する様子も観察された。次に特定の位置にニックを挿入した2本鎖DNAを用いたところ、DNAポリメラーゼβはニック部分に優先して結合した。また、疎水性ガラス表面に片端固定したあと直流電場によって伸張させたDNAに相互作用するDNAポリメラーゼβの挙動を観測することを試みた。DNaseIによってランダムにニックやギャップを入れたDNAを用いた場合にDNAポリメラーゼβは電界中で伸張するDNAに結合し、20V/cmの直流電界中で遊離することなくDNAに結合した状態を保持した。
本研究により開発された疎水性ガラス基板へのDNAの固定化法は、ガラス表面へのDNA分子の非特異的吸着を抑制できるために顕微鏡下でのDNA-酵素間相互作用の解析に有用であると考えられる。また、直流電場によるDNAの形態制御およびDNA結合性酵素の蛍光標識法は、DNAに相互作用する様々なタンパク質(酵素)の動態解析に大きく寄与するものと期待される。
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