| Budget Amount *help |
¥1,900,000 (Direct Cost: ¥1,900,000)
Fiscal Year 2003: ¥700,000 (Direct Cost: ¥700,000)
Fiscal Year 2002: ¥900,000 (Direct Cost: ¥900,000)
Fiscal Year 2001: ¥300,000 (Direct Cost: ¥300,000)
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| Research Abstract |
平成14年度の研究において肝機能の臨床検査薬として利用されている不完全糸状菌Myrothecium verrucaria由来のビリルビンオキシダーゼの組換え体は天然型酵素と異なるフォームで発現していることを明らかにしたが,このフォームについてさらに詳しく検討した。その結果,タイプ2銅とタイプ3銅からなる三核銅部位において,水酸基がタイプ2銅と一方のタイプ3銅との間で架橋していることがわかった。あるいはこれらが還元された状態にあり,もう一つのタイプ3銅が磁気的に孤立してESRスペクトルで検出されていることがわかった。このESRシグナルは低分子系では観測されたことにない極めて異常なCu(II)由来のシグナルである。このような休止状態の相違にもかかわらず,組換え体は,天然型酵素と同様の反応を行い,酸素還元種が観測できることがわかった。また,反応のターンオーバーが一回完結すると,組換え体の酸素還元部位は天然型酵素と同じ状態に至ることがわかった。すなわち,休止状態の三核銅部位は,酵素反応中には存在しないフォームで存在していることがわかった。
一方,ビリルビンオキシダーゼのミュータントを数種類作成した。タイプ1銅に配位したMetをGlnに変異させたところ,天然型酵素の反応では観測するのが困難な酸素還元種が容易に検出されることを見出したが,時間の関係上,予備データの取得にとどまった。また,マルチ銅オキシダーゼで保存されているAspが酸素還元種へのプロトンソースであると予測し,このアミノ酸のAla変異体を作成したところ,非配位性アミノ酸であるにも関わらず,三核銅部位には,平均1個しか銅が入らないことがわかった。この事実から,このAsp残基は酸素還元だけではなく酸素還元部位の構造形成にも重要であることがわかった。
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