| Project/Area Number |
01J00809
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| Research Category |
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Section | 国内 |
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| Research Field |
生物形態・構造
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
山形 敦史 大阪大学, 大学院・理学研究科, 特別研究員(PD)
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| Project Period (FY) |
2001 – 2002
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| Project Status |
Completed (Fiscal Year 2002)
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| Budget Amount *help |
¥2,000,000 (Direct Cost: ¥2,000,000)
Fiscal Year 2002: ¥1,000,000 (Direct Cost: ¥1,000,000)
Fiscal Year 2001: ¥1,000,000 (Direct Cost: ¥1,000,000)
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| Keywords | DNA修復 / 相同組換え / X線結晶解析 / マンガンイオン / エキソヌクレアーゼ / DHHファミリーモチーフ |
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| Research Abstract |
RecJは相同組換え、塩基除去修復、ミスマッチ修復に関わる、一本鎖DNA特異的なエキソヌクレアーゼである。特に近年、組換えと複製の総合関係に重要な役割を果たすことで注目を集めている酵素である。我々は、高度好熱菌Thermus thermophilus HB8を材料として、そのRecJ遺伝子のクローニング及び発現・精製を行った。我々は前年度までの研究概要報告書に述べたように、このRecJのX線結晶解析に既に成功している。RecJは5つの特徴的なモチーフを持っており、このモチーフを持つ蛋白質群はDHHファミリーとよばれる巨大な蛋白質ファミリーを形成する。我々が明らかにしたRecJの立体構造から、この5つのモチーフのうち4つのモチーフで保存される残基によって、活性に必須なマンガンイオンが配意されていることが分かった。また近年、他グループによって他のDHHファミリー酵素、Family IIのピロリン酸分解酵素の立体構造が明らかにされた。この酵素もまたRecJと同様にDHHファミリーのモチーフ4つでマンガンイオンを配位していた。両酵素の立体構造の重ね合わせにより、これらモチーフが完全に重なり合うことが分かり、DHHファミリーモチーフによる金属結合が高度に保存されていることが示された。ピロリン酸分解酵素の立体構造との比較も考察に入れ、我々はRecJの立体構造からAsp 80,Asp 82,Asp 159,His 161が活性に必須な残基であると予測した。それらはDHHファミリーモチーフに高度に保存されていた。我々はそれらの残基の部位特異的変異体を作り、それらのエキソヌクレアーゼ活性を調べたところ、活性の消失または著しい減少が見られた。これらの結果を基に、RecJの反応機構モデルを提出した。
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