ビタミンD_3の代謝に関わる酵素の構造と機能に関する研究
Project/Area Number |
01J03408
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Research Category |
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
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Allocation Type | Single-year Grants |
Section | 国内 |
Research Field |
応用微生物学・応用生物化学
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Research Institution | Kyoto University |
Principal Investigator |
澤田 夏美 京都大学, 農学研究科, 特別研究員(DC2)
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Project Period (FY) |
2001 – 2002
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Project Status |
Completed (Fiscal Year 2002)
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Budget Amount *help |
¥2,000,000 (Direct Cost: ¥2,000,000)
Fiscal Year 2002: ¥1,000,000 (Direct Cost: ¥1,000,000)
Fiscal Year 2001: ¥1,000,000 (Direct Cost: ¥1,000,000)
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Keywords | ビタミンD / シトクロムP450 / 大腸菌発現系 / ビタミンD水酸化酵素 / 代謝予測 / 部位特異的変異 |
Research Abstract |
(1)ヒト由来ビタミンD_3 24位水酸化酵素(CYP24)によるビタミンD_3透導体の代謝 ヒト由来CYP24を大腸菌で発現させ、活性を上昇させるために電子供与体との同時発現を試みた。菌体培養液あるいは膜画分に、副甲状腺亢進症の治療薬であるビタミンD_3-ヘキサフルオロ体を添加し、代謝産物をHPLCおよび質量分析計により分析した。その結果、ヘキサフルオロ体は23S位水酸化体、続いて23位オキソ体、さらに構造未知の代謝物へと変換されること、別の代謝経路として側鎖が切断され完全に不活化されることが明らかになった。23S位水酸化に始まる代謝経路の最後の代謝物はラット由来CYP24には見られず、動物種差が認められた。 (2)ヒト由来CYP27A1の基質特異性の改変 くる病患者由来CYP27B1(ビタミンD_31α位水酸化酵素)変異型酵素の解析およびコンピューターモデリングにより予測したCYP27B1の立体構造からCYP27B1のGln65が基質25-ヒドロキシビタミンD_3[以下25(OH)D_3]との結合に関与することが示唆された。一次構造上の相同性が40%で25(OH)D_3の1α位水酸化活性を有するCYP27A1(ビタミンD_325位水酸化酵素)についてCYP27B1のGln65に相当するGln85の変異体を作製し,その性質を調べた。正常型CYP27A1は25(OH)D_3の1α位,24位および26位の3箇所を水酸化し、その活性はそれぞれ10,8,26(mmol/min/P450)であり、Q85Hでは,0,20,4(mmol/min/mol P450)であった。これらの結果からCYP27B1のGln65,CYP27A1のGln85は1α位水酸化活性において重要な役割を果たすことがわかった。また,CYP27A1のGln85は1α位水酸化活性とは異なる結合様式で発揮される25(OH)D_3の側鎖の水酸化にも関与することがわかった。
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Report
(1 results)
Research Products
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