生体受容体を機能材料として開発するための基礎的研究

• Project/Area Number: 02205094
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• Allocation Type: Single-year Grants
• Research Institution: The University of Tokushima
• Principal Investigator: 蛯名 洋介 徳島大学, 酵素科学研究センター, 教授 (00112227)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 林 日出喜 徳島大学, 酵素科学研究センター, 助手 (10218589) ; 村上 尚 徳島大学, 酵素科学研究センター, 助手 (40210009)
• Project Period (FY): 1990
• Project Status: Completed (Fiscal Year 1990)
• Budget Amount: ¥2,000,000 (Direct Cost: ¥2,000,000); Fiscal Year 1990: ¥2,000,000 (Direct Cost: ¥2,000,000)
• Keywords: インスリンレセプタ- / 機能材料 / 遺伝子工学

Research Abstract

我々はレセプタ-タンパクを高純度大量精製するために、レセプタ-タンパクを機能を保ったまま細胞外培養液中に放出させることを試みた。インスリンレセプタ-タンパクのβサブユニットには23個の疎水性アミノ酸が連続する膜通過部位が存在し、そこが細胞膜の脂質分画と親和性を持ち、細胞膜に固定されているものと考えられる。そしてその23個の疎水性アミノ酸の後には3個の親水性のアミノ酸が続いており、もうそれ以上膜内に入り込まないようになっていると考えられる。そこで手始めとして、この23個の疎水性アミノ酸を欠失したレセプタ-タンパクを細胞中で強制発現させることを試みた。遺伝子工学の手法を用いcDNA上でこの23個のアミノ酸を欠失したものを作製し、それを発現ベクタ-に組み込み動物細胞で発現させた。この人工変異レセプタ-タンパクにはインスリンは結合するが、細胞膜上には出ていかず、細胞外にも存在しない。このレセプタ-タンパクはほとんどが細胞内にとどまっているようであった。このように大きな欠失を伴うと、タンパクの高次構造が大きく変化してしまい、細胞表面上にも出ていかなくなるものと推測している。そこで現在この膜通過部位の中及び周辺に小さな欠失を作ったり、またアミノ酸置換などをcDNA上で作製し、インスリンレセプタ-の機能(インスリンの結合能と、それにより活性化されるチロシンキナ-ゼ活性)は保持したまま細胞培養上清中にインスリンレセプタ-タンパクを出することを検討した。膜通過部位5つのアミノ酸を欠失させたり、また膜通過部位のすぐ後の3個の親水性アミノ酸を欠失させても、このタンパクは細胞膜上にとどまり、インスリン結合能、リン酸化活性は正常であった。またこの両者を欠失しているレセプタ-を作製したがこれはβサブユニットのチロシンキナ-ゼ活性を失っていた。

Research Products

• [Publications] Shimada,F.,Ebina,Y.et al.: "Insulinーresistant diabetes associated with partial deletion of insulinーreceptor gene." The Lancet. 335. 1179-1181 (1990)
• [Publications] Araki,E.,Ebina,Y.et al.: "A cluster of four Spl binding sites required for efficient expression of the human insulin receptor gene." J.Biol.Chem.
• [Publications] Hayashi,H.,Ebina,Y.et al.: "Evidence that phosphatidylinositol 3 kinase is a substrate for insulin receptor tyrosine kinase." J.Biol.Chem.