アメリカザリガニの硬組織の石灰化に関与する有機基質に関する研究

• Project/Area Number: 02J08527
• Research Category: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• Allocation Type: Single-year Grants
• Section: 国内
• Research Field: Bioproduction chemistry/Bioorganic chemistry
• Research Institution: The University of Tokyo
• Principal Investigator: 井上 宏隆 東京大学, 大学院・農学生命科学研究科, 特別研究員(DC1)
• Project Period (FY): 2002 – 2004
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2004)
• Budget Amount: ¥3,500,000 (Direct Cost: ¥3,500,000); Fiscal Year 2004: ¥1,000,000 (Direct Cost: ¥1,000,000); Fiscal Year 2003: ¥1,000,000 (Direct Cost: ¥1,000,000); Fiscal Year 2002: ¥1,500,000 (Direct Cost: ¥1,500,000)
• Keywords: バイオミネラリゼーション / 石灰化 / クチクラタンパク質 / アメリカザリガニ / キチン / 炭酸カルシウム / カルシウム結合タンパク質 / 外骨格

Research Abstract

1.外骨格基質ペプチドCAP-1の構造活性相関
アメリカザリガニの外骨格から単離されたCAP-1はin vitroにおいて、炭酸カルシウム結晶形成阻害活性とカルシウム結合活性を有しており、外骨格の石灰化に重要な役割を果たしていると考えられる。これらのin vitroにおける機能と構造の関連性を明らかとするために、大腸菌を宿主とした、様々な変異体CAP-1の発現系を構築した。得られたこれらのペプチドについて、炭酸カルシウム結晶形成阻害活性とカルシウム結合活性を調べた結果、C末端酸性領域を削除したペプチドはどちらの活性も低下したことから、C末端酸性領域がカルシウムイオンおよび炭酸カルシウム結晶との相互作用に重要であることがわかった。また、これらのペプチドについてCDスペクトルを測定した結果、すべてのペプチドはカルシウム濃度依存的にスペクトルが変化することがわかった。その中でもN末端領域を削除したペプチドは、他のペプチドと比較してスペクトルが大きく異なり、カルシウムによるスペクトル変化の割合も小さいことがわかった。以上の結果から、CAP-1のN末端領域はペプチドの構造の維持とカルシウムによる構造変化に何らかの寄与をしていることがわかった。
2.CAP-1の発現制御機構の解明
CAP-1は外骨格の石灰化が起こる脱皮後期特異的に発現していることから、エクジステロイドにより誘導される初期もしくは後期遺伝子によって、その発現が制御されていると考えられた。そこで、表皮組織を組織培養した結果、エクジステロイド存在下で一定時間培養した後に、非存在下で培養することによって、その発現が誘導されることがわかった。また、CAP-1の転写制御領域をクローニングし、哺乳類細胞、昆虫細胞を用いてレポーターアッセイを行ったが、転写活性化能に差は認められなかった。

Research Products

• [Journal Article] バイオミネラリゼーションの科学 (2005)
  • Author(s): 長澤寛道, 井上宏隆
  • Journal Title: ケミカルエンジニアリング 50 Pages: 43-48
• [Journal Article] A novel calcium-binding peptide from the cuticle of the crayfish. Procambarus clarkii (2004)
  • Author(s): Inoue, H., Ohira, T., Ozaki, Y., Nagasawa, H.
  • Journal Title: Biochem.Biophys.Res.Commun. 318 Pages: 649-654
• [Journal Article] Characterization of Prismalin-14. a novel matrix protein from the prismatic layer of the Japanese pearl oyster, Pinctada fucata (2004)
  • Author(s): Suzuki, M., Murayama, E., Inoue, H., Ozaki, N., Tohse, H., Kogure, T., Nagasawa.H.
  • Journal Title: Biochem.J. 382 Pages: 205-213
• [Publications] Inoue, H., Ohira, T., Ozaki, N., Nagasawa, H.: "Cloning and Expression of a cDNA Encoding a Matrix Peptide Associated with Calcification in the Exoskeleton of the Crayfish"Comparative Biochemistry and Physiology. 136B. 755-765 (2003)
• [Publications] Inoue, H: "Structure and Function of Matrix Peptides Associated with Calcification in the Exoskeleton of the Crayfish"第39回ペプチド討論会プロシーディング. (印刷中).