都市域内高度水循環システム構築にための下水処理水からの病原ウイルス除去技術開発

• Project/Area Number: 02J10644
• Research Category: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• Allocation Type: Single-year Grants
• Section: 国内
• Research Field: Civil and environmental engineering
• Research Institution: Tohoku University
• Research Fellow: 佐野 大輔 東北大学, 大学院・工学研究科, 特別研究員(PD)
• Project Period (FY): 2002 – 2003
• Project Status: Completed(Fiscal Year 2003)
• Budget Amount: ¥2,500,000 (Direct Cost : ¥2,500,000); Fiscal Year 2003 : ¥1,000,000 (Direct Cost : ¥1,000,000); Fiscal Year 2002 : ¥1,500,000 (Direct Cost : ¥1,500,000)
• Keywords: ウイルス吸着タンパク質(Virus-Binding Protein : VBP) / 活性汚泥 / アフィニティクロマトグラフィ / 病原ウイルス / VBPクローニング / アミノシラン / ポリリジンタグ / ELISA / VBP遺伝子 / N末端アミノ酸配列

Research Abstract

病原ウイルスに対する親和性の高いタンパク質(ウイルス吸着タンパク質:Virus-Binding Protein,VBP)を活性汚泥中から分離し,このVBPを用いた下水処理水からの病原ウイルス除去技術を開発することが本研究の目的である.平成14年度において,活性汚泥からポリオウイルス1型に対する親和性を有するVBPを分離し,さらに活性汚泥細菌からのVBP遺伝子の分離、およびVBPクローニングを行うことに成功した.本年度は,得られたVBPクローンの担体表面上への固定化及びVBPを用いたウイルス除去装置の構築を試み,以下に述べる成果を得た.
まず,大腸菌を用いたVBPクローニングにより大量に得られたVBPを,担体として用いるガラスビーズ表面上に固定化することを試みた.その際には,まずガラスビーズ表面をアミノシランで修飾し,さらにグルタルアルデヒドを導入した.それに続いてVBPを導入することで,VBP間の架橋を最小限に抑えつつ,ガラスビーズ表面からVBPまでを共有結合により強く結合させた.本手法を用いることにより,VBPが確かにガラスビーズ表面上に固定化されていることをELISA法により確認した.
次に,固定化されたVBPを用いたポリオウイルス1型(PV1)吸着実験を行った.2mlチューブにVBP固定化ガラスビーズ1gを投入し,そこへPV1懸濁液1mlを添加した.1時間撹拌後,静置した上清をサンプリングし,上清に残ったPV1を定量した.その結果,投入PV1のうち95%がガラスビーズ表面上のVBPによって吸着除去されたことが確認された.
さらに,ガラス粒子表面上におけるVBPの配向固定化を実現するため,VBPのC末端にポリリジンタグを導入したLysTag-VBPの合成を試みた.ポリリジンタグ導入用のプライマーを設計し,PCR反応によりLysTag-VBP遺伝子を創出した.このLysTag-VBP遺伝子を組み込んだプラスミドpRSETを大腸菌に導入して培養したところ,LysTag-VBPを効率的に合成することに成功した.上述の固定化手法を用いてガラスビーズ表面上にLysTag-VBPを固定化し,固定化されたLysTag-VBPを用いてPV1吸着実験を行ったところ,固定化LysTag-VBPとPV1型間の結合が親和性の高いものであることが確認された.
以上の結果より,VRPを利用した水中病原ウイルス除去技術の開発に成功し、本研究の目的がすべて達成されたと言える.

Research Output

• [Publications] Daisuke Sano, Takahiro Matsuo, Tatsuo Omura: "Virus-binding proteins recovered from bacterial culture derived from activated sludge by the affinity chromatography using a viral capsid peptide"Applied and Environmental Microbiology. (Accepted). (2004)
• [Publications] Daisuke Sano, Toru Watanabe, Takahiro Matsuo, Tatsuo Omura: "Detection of infectious pathogenic viruses in water and wastewater samples from urbanized areas"Water Science and Technology. (Accepted). (2004)
• [Publications] Takahiro Matsuo, Daisuke Sano, Kensuke Fukushi, Tatsuo Omura: "Adsorption of Poliovirus 1 and Adenovirus 41 to Virus-Binding Proteins"Proceeding of the Asian Waterqual 2003. (2003)
• [Publications] Daisuke Sano, Kensuke Fukushi, Yasuko Yoshida, Tatsuo Omura: "Detection of enteric viruses in municipal sewage sludge by a combination of the enzymatic virus elution method and RT-PCR"Water Research. 37(14). 3490-3498 (2003)
• [Publications] Taro Antsuki, Daisuke Sano, Tatsuo Omura: "Functional metal-binding proteins by metal-stimulated bacteria for the development of an innovative metal removal technology"Water Science and Technology. 47(10). 109-115 (2003)
• [Publications] 松尾崇宏, 佐野大輔, 大村達夫: "活性汚泥からのウイルス吸着タンパク質(Virus-Binding Protein : VBP)の分離およびその吸着能評価"第57回土木学会年次学術講演会講演集. 57. 335-336 (2002)
• [Publications] 松尾崇宏, 佐野大輔, 大村達夫: "アフィニティクロマトグラフィによる活性汚泥からのウイルス吸着タンパク質(Virus-Binding Protein : VBP)の分離と特性評価"環境工学研究論文集. 39. 345-353 (2002)
• [Publications] 佐野大輔, 大村達夫: "活性汚泥細菌から分離されたウイルス吸着タンパク質とポリオウイルス粒子間の相互作用評価"平成14年度土木学会東北支部技術研究発表会. (発表予定). (2003)