ヒンジヘリックスを組込んだ新規DNA副溝認識型亜鉛フィンガー蛋白質の創製と機能
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03J05604
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| Research Category |
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Section | 国内 |
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| Research Field |
医薬分子機能学
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
白石 泰久 京都大学, 薬学研究科, 特別研究員(DC1)
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| Project Period (FY) |
2003 – 2005
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| Project Status |
Completed (Fiscal Year 2005)
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| Budget Amount *help |
¥2,700,000 (Direct Cost: ¥2,700,000)
Fiscal Year 2005: ¥900,000 (Direct Cost: ¥900,000)
Fiscal Year 2004: ¥900,000 (Direct Cost: ¥900,000)
Fiscal Year 2003: ¥900,000 (Direct Cost: ¥900,000)
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| Keywords | 亜鉛フィンガー / ヒンジヘリックス / Sp1 / GLI / 塩基認識 / リンカー / β-シート |
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| Research Abstract |
Lac repressor内のヒンジヘリックスは、DNAの副溝結合能、2量体形成能、DNA湾曲能といった亜鉛フィンガータンパク質に見られないユニークな機能を有することから、この機能ドメインを亜鉛フィンガータンパク質に組込むことで、亜鉛フィンガータンパク質の機能拡張や医学的な応用において、大きな可能性を与えることが期待される。これまでに私が遂行してきた亜鉛フィンガータンパク質の構造・活性相関に関する研究成果に加え、亜鉛フィンガータンパク質のリンカー領域がDNAの副溝に近接することを考慮して、亜鉛フィンガードメインを連結するリンカー領域にヒンジヘリックスを組込むことにした。
亜鉛フィンガータンパク質としては、構造面並びに機能面での知見が豊富なヒト由来のSp1亜鉛フィンガーを選択した。この亜鉛フィンガータンパク質のC末端側にヒンジヘリックスを融合することにし、その際、亜鉛フィンガードメインによる構造面での影響を排除するために、グリシン残基を挿入することにした。基質DNAとしては、2量体形成を考慮して、2つの結合サイトを対称に配置したものを用意した。
このタンパク質は、大腸菌体内で発現させ、陽イオン交換とゲルろ過を組み合わせることで精製した。DNA結合親和性への影響について、ゲルシフト法により評価を行った。その結果、2量体形成に伴う結合親和性の相乗的な向上は見られなかった。今後さらなる基質DNAの最適化が必要と考えられる。一方で、ヒンジヘリックスと平行して、金属結合型ペプチドを挿入した変異体では、新規なDNA切断活性を示すことを明らかにした。以上の研究成果は、今後の亜鉛フィンガータンパク質の高機能化や応用研究において、有用な知見を与えてくれるものであると考えられる。
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Report
(3 results)
Research Products
(5 results)
