修飾オリゴヌクレオチドを用いたT4エンドヌクレアーゼVの基質認識機構の解析

• Project/Area Number: 04254201
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• Allocation Type: Single-year Grants
• Research Institution: Hokkaido University
• Principal Investigator: 森岡 弘志 北海道大学, 薬学部, 助手 (20230097)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 紙谷 浩之 北海道大学, 薬学部, 教務職員 (10204629) ; 井上 英夫 北海道大学, 薬学部, 助教授 (80088856) ; 大塚 栄子 北海道大学, 薬学部, 教授 (80028836)
• Project Period (FY): 1992
• Project Status: Completed (Fiscal Year 1992)
• Budget Amount: ¥1,700,000 (Direct Cost: ¥1,700,000); Fiscal Year 1992: ¥1,700,000 (Direct Cost: ¥1,700,000)
• Keywords: T4エンドヌクレアーゼV / チミンダイマー / ホスホロチオエート / フィルターバインディングアッセイ / 酵素一基質複合体 / メチル化保護法

Research Abstract

1.チミンダイマー部分のリン酸基をホスホロチオエート結合に修飾したオリゴヌクレオチド(dGCACGT[ps]TGCACG、T[ps]T:ホスホロチオエート結合を有するチミンダイマー誘導体)およびその相補鎖(dCGTGCAACGTGC)を化学合成し、T4エンドヌクレアーゼVの基質として用いた。なお、解析にはリン酸結合の2種類のジアステレオ異性体(Rpホスホロチオエート体、Spホスホロチオエート体)をそれぞれ用いた。
フィルターバインディングアッセイにより酵素ー基質複合体の解離定数を求めると、通常のチミンダイマーを含む基質を用いた場合には1.6×10^<-8>M、Rpホスホロチオエート体では5.3×10^<-9>M、Spホスホロチオエート体で1.4×10^<-7>Mとなり、両ジアステレオ異性体の間で酵素との結合性に大きな違がみられた。すなわち、Rpホスホロチオエート体の方がSpホスホロチオエート体よりも酵素に対する親和性が高いことがわかった。また、反応速度定数からも同様の結果が得られ、チミンダイマー部分のリン酸残基が酵素と相互作用していることが明らかにされた。
2.チミジン2量体に光照射を行うことによって得られた結合ユニットを用いて、チミンダイマーを含むオリゴヌクレオチドおよびその相補鎖を合成した。これらを基質としてメチル化保護実験を行い、T4エンドヌクレアーゼVが特異的に認識しているDNA領域の検索およびその結合様式の解析を試みた。
2本鎖DNA中のチミンダイマー部位の相補鎖則アデニン塩基の3位のメチル化が特異的に阻止されたことから、T4エンドヌクレアーゼVが基質DNAのチミンダイマー部位に対してマイナーグルーブ側から結合していることが明らかにされた。