ヒトH±ATP合成酵素のsubunitb遺伝子の発現制御機作

• Project/Area Number: 04680196
• Research Category: Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Research Field: 代謝生物化学
• Research Institution: The University of Tokushima
• Principal Investigator: 樋口 富彦 徳島大学, 薬学部, 助教授 (50035557)
• Project Period (FY): 1992
• Project Status: Completed (Fiscal Year 1992)
• Budget Amount: ¥1,900,000 (Direct Cost: ¥1,900,000); Fiscal Year 1992: ¥1,900,000 (Direct Cost: ¥1,900,000)
• Keywords: ATP合成酵素 / subunit b / 遺伝子 / 転写制御 / シス-要素 / トランス作働性因子 / ミトコンドリア

Research Abstract

本研究では,ヒト癌細胞であるHela細胞を用いてCATassayを行い,ヒトのH^+‐ATP合成酵素のsubunit b遺伝子の第1イントロン内に約16倍もの転写活性を促進するエンハンサーが存在することが明らかとなった.なお,第1イントロンを解析する場合は,subunit b遺伝子の開始コドンとCAT遺伝子の開始コドンの2つが存在することから,フレームシフト等の問題が生じる可能性が考えられたのでmRNAの発現量を直接比較することが出来るRibonuclease protection assay(RPA)法を用いた.ついで,この高い転写活性を持つエンハンサーは,本遺伝子の+160〜+186までの27bpに存在することが明らかとなった.そのエンハンサーは,Sp1タンパク質が結合する配列と100%のホモロジーを示したので,次に部位特異変異体を導入した遺伝子を用いてRPA法を行ったところ,いずれの遺伝子においても転写活性が減少した.特に,Sp1タンパク質が結合すると予測した変異体においては,転写の活性が低下した.さらに,その部位への蛋白質の結合をゲルシフト法によって確認したところ,3〜4種の核抽出蛋白質が第1イントロン内のエンハンサーに結合することが確かめられた.次にsubunit b遺伝子の5'上流領域について解析したところ,-1.3kbp-466bpの間に強力なサイレンサーエレメントが存在すること,そしてGCboxが転写に関係していることが明らかとなった.
現在,当研究室では,ヒトのH^+-ATP合成酵素のFoサブユニットの1つであるsubunit c遺伝子(2種)の解析も行っており,subuni b遺伝子の上流領域のついての解析との比較検討とin vitro転写系の開発により,ミトコンドリアの形態形成に関わる核遺伝子の制御システムが解明されるものと期待される.

Research Products

• [Publications] Inoue,I., 他: "An ATP‐sensitive K^+ channel in the membrane of fused giant mitoplast." J.Physiol.446. 130 (1992)
• [Publications] Higuti,T., 他: "A Simple,Rapid Method for Purification of ε‐Subunit,Coupling Factor 6,Subunit d,and Subunit e from Rat Liver H^+‐ATP Synthase and Determination of the Complete Amino Acid Sequence of ε‐Subunit." J.Biol.Chem.267. 22658-22661 (1992)
• [Publications] Higuti,T., 他: "The Complete Amino Acid Sequence of Subunit e of Rat Liver Mitochondrial H^+‐ATP Synthase." Biochemistry. 31. 12451-12454 (1992)
• [Publications] Higuti,T., 他: "Molecular cloning and sequence of cDNAs for the import precursors of oligomycin sensitivity conferring protein,ATP ase inhibitor protein,and subunitc of H^+‐ATP synthase in rat mitochondria." Biochim.Biophys.Acta. (1993)
• [Publications] Higuti,T., 他: "Molecular cloning and sequence of two cDNAs for human subunit c of H^+‐ATP synthase in mitochondria." Biochim.Biophys.Acta. (1993)
• [Publications] 樋口 富彦 (分担): "エネルギー変換システム 「生体超分子システム--生命理解のかなめ--」 猪飼 篤,樋口富彦,吉村哲郎,田中啓二編 蛋白質核酸酵素増刊号" 共立出版, (1993)
• [Publications] Higuti,T.: "Function of Mitochondrial H^+_-Pumps as a Molecular Parallel Condenser.In:New Functionality Materials:Design,Preparation and Control(Tsuruta,T Seno,M.,and Doyama,M.eds.)" Elsevier Science Publishers B.V., (1993)