| Project/Area Number |
04F02513
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| Research Category |
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Section | 外国 |
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| Research Field |
応用微生物学・応用生物化学
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| Research Institution | Tohoku University |
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| Host Researcher |
神尾 好是 東北大学, 大学院・農学研究科, 教授
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| Foreign Research Fellow |
ANH Hoa Nguyen 東北大学, 大学院・農学研究科, 外国人特別研究員
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| Project Period (FY) |
2002 – 2004
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| Project Status |
Completed (Fiscal Year 2004)
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| Budget Amount *help |
¥1,200,000 (Direct Cost: ¥1,200,000)
Fiscal Year 2004: ¥1,200,000 (Direct Cost: ¥1,200,000)
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| Keywords | Erwinia carotovora / カロトボリシン / バクテリオシン / 1分子技術 / 標的細胞認識 |
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| Research Abstract |
Erwinia carotovora subsp. carotovora Erは、nalidixic acid、mitomycin C、あるいはbleomycinの攻撃にさらされたときに、carotovoricin Erを産生し、類縁バクテリアを殺菌する。今日まで、Hoa Anh Nguyen博士は
(1)tail fiberのC末端の5アミノ酸残基がcarotovoricinの抗菌スペクトルを左右することを明らかにした。
(2)「1分子計測技術」を用いて外殻牽引開始の作用機序解明のための毒素分子を用いたモデル実験を行い以下の成果を上げた。
(1)標的細胞膜上における水可溶LukFのプレステム領域の水不溶ステムへの劇的な構造変化を伴うステムの標的細胞膜貫通機構を解明した。
(2)さらに『プレスム保有ヘテロ7量中間体』を発見し,BADAN蛍光色素標識毒素成分を調製すると共にHlg2成分共同での膜孔形成過程を追求し、プレステムからステムへの移行タイミングを決定した。具体的には、以下の1〜3の実験を行い、膜孔の形成時のリアルタイム可視化に成功した。
実験1・Hlg2のT29残基のCys変異体を作製した。次に、Hlg2(T29C)へのnitrobenzyl bromide(NB)への導入誘導体を作製した。
実験2・LukFのT117残基(T117は本来ステムになる領域に存在する残基であるが、モノマー状態ではLukFのキャップ領域に結合してプレステム状態になっている)のCys残基への変換体を作製した。本変異体に、疎水環境に置かれてのみ蛍光を発する蛍光色素BADAN(387nm exitation/520nm emission)を導入した。
実験3・上記2種類の誘導体を赤血球ゴースト膜上で混合し、387nmの波長をフラッシュした。すぐに520nmで発光を追跡した。紫外線によるHlg2からのNBの遊離すると、BADAN-LukF誘導体とHlg2が集合し7量中間体形成後、膜上でプレステムからステムが形成され、これが疎水性の膜に突き刺さった時点で発光が生じるのでこれを「一分子技術」で観察した。生じた蛍光を倒立蛍光顕微鏡下で超高感度カメラで経時的に観測して蛍光強度を定量化した。
本成果をcarotovoricin Erの細菌膜への組込み機構の解明に大いに役立つことが期待される。以上の成果をNature Structural Biologyに投稿予定である。
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