タンパク質間相互作用解析に用いる新規プロテインチップの開発

Research Project

Project/Area Number	04F04221
Research Category	Grant-in-Aid for JSPS Fellows
Allocation Type	Single-year Grants
Section	外国
Research Field	Applied molecular and cellular biology
Research Institution	Yokohama City University
Host Researcher	平野久横浜市立大学, 大学院・国際総合科学研究科, 教授
Foreign Research Fellow	談建中横浜市立大学, 大学院・国際総合科学研究科, 特別研究員 TAN J.
Project Period (FY)	2004 – 2005
Project Status	Completed(Fiscal Year 2005)
Budget Amount *help	¥2,400,000 (Direct Cost : ¥2,400,000) Fiscal Year 2005 : ¥1,200,000 (Direct Cost : ¥1,200,000) Fiscal Year 2004 : ¥1,200,000 (Direct Cost : ¥1,200,000)
Keywords	プロテインチップ / DLC基板 / 二次元電気泳動 / 質量分析 / タンパク質間相互作用 / ダイズ / 胚軸 / 子葉
Research Abstract	本研究は、ダイヤモンド様炭素被膜処理基板(DLC基板)上に二次元電気泳動で分離されたタンパク質を電気泳動的に転写してプロテインチップを作製し、チップ上のタンパク質にタンパク質溶液を反応させた後、相互作用するタンパク質を質量分析装置で転写するハイスループットな方法を確立すること、また、確立された方法を用いて二次元電気泳動で分離されたダイズ種子胚軸タンパク質と相互作用するタンパク質を検出し、タンパク質間相互作用マップを作成することを目的とした。これまで電気泳動で分離されたタンパク質をDLC基板に転写する効率が同じタンパク質であっても異なることがあった。本年度、その原因を追究した。その結果、ブロッティング時の温度変化が効率の変動に関係があることがわかった。そこで、温度を厳密に制御できるブロッティング装置を設計・製作し、種々の温度で転写実験を行って安定的、かつ効率的にブロッティングを行うことができる温度条件を調べた。その結果、かなり高温(30℃)でブロッティングを行うと最も効率よくタンパク質を転写できることがわかった。一方、昨年度、ダイズ種子胚軸タンパク質を二次元電気泳動で分離し、約500のタンパク質を検出した。検出されたタンパク質のアミノ酸配列を質量分析装置によって分析し、アミノ酸配列から各タンパク質を同定した。これと種子子葉タンパク質の分析結果とを比較したところ、すべてではなく、特定の種子貯蔵タンパク質が胚軸と子葉の両方で発現していることがわかった。これらのタンパク質は、特別な機能を持っている可能性がある。そこで、DLC基板を用いてこれらのタンパク質と相互作用するタンパク質の検出を試みた。