蛍光標識アミノ酸の部位特異的導入による細胞内タンパク質の動態機能解析法の開発
| Project/Area Number |
04J04927
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| Research Category |
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Section | 国内 |
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| Research Field |
Chemistry related to living body
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| Research Institution | Okayama University |
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| Research Fellow |
梶原 大介 岡山大学, 自然科学研究科, 特別研究員(DC2)
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| Project Period (FY) |
2004 – 2005
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| Project Status |
Completed (Fiscal Year 2005)
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| Budget Amount *help |
¥1,900,000 (Direct Cost: ¥1,900,000)
Fiscal Year 2005: ¥900,000 (Direct Cost: ¥900,000)
Fiscal Year 2004: ¥1,000,000 (Direct Cost: ¥1,000,000)
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| Keywords | 無細胞蛋白質合成系 / 4塩基コドン法 / 非天然アミノ酸 / 蛍光性アミノ酸 / 蛍光二重標識 / 蛍光共鳴エネルギー移動(FRET) / 蛋白質構造変化 / 無細胞タンパク質合成系 / 蛍光標識アミノ酸 / タンパク質コンフォメーション変化 / カルモジュリン |
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| Research Abstract |
1)カルモジュリンへの2種類の蛍光性アミノ酸の導入による、コンフォメーション変化の検出
蛍光ドナーアミノ酸;BODIPYFL-AF、蛍光アクセプターアミノ酸;BODIPY558-AFに、4塩基コドンCGGG、GGGUをそれぞれ割り当てることにより、部位特異的に二種類の蛍光性アミノ酸が導入されたカルモジュリンを生合成した。さまざまな部位にドナーアミノ酸を導入したカルモジュリンを合成し、基質ペプチドの添加に伴う蛍光スペクトルの変化を追跡した。その結果、アクセプターアミノ酸をN末端に持ち、ドナーアミノ酸を40位、99位、112位にそれぞれ有する二重標識カルモジュリンにおいて、ドナー強度の上昇と、アクセプター強度の減少という、FRET効率の変化が確認された。すなわち基質ペプチドの結合によるカルモジュリンのコンホメーション変化が観測できた。また、蛍光偏光度測定により二重蛍光標識カルモジュリンのペプチドに対する結合活性を確認したところ、FRET変化の起こったカルモジュリンに関してはすべて結合活性の保持が確認された。さらに、ストップトフローを用いて、その蛍光変化をリアルタイムに検出することができた。
2)マルトースバインディングプロテイン(MBP5)のシャペロニンGroEL中でのフォールディング過程の検出
シャペロニン中での基質タンパク質のフォールディングメカニズムの解明を行うためには、GroEL、GroES、ATPなどが混在する中での目的タンパク質のみの構造変化をリアルタイムに検出する必要がある。そこで、上記手法を用いたFRET分析により、シャペロニン中でのMBP5のフォールディング過程の検出を行った。変性MBP5をシャペロニンGroEL/ES/ATP存在下で同様にFRET分析したところ、FRET効率の回復が確認された。これにより、シャペロニン中でのリフォールディング過程が検出できる可能性を示した。
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Report
(2 results)
Research Products
(1 results)
