非天然補欠分子を導入した超高機能化ヘムタンパク質の創製
| Project/Area Number |
04J06764
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| Research Category |
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Section | 国内 |
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| Research Field |
Chemistry related to living body
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| Research Institution | Kyushu University |
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Principal Investigator |
村田 大 九州大学, 大学院工学研究院, 特別研究員(DC1)
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| Project Period (FY) |
2004 – 2006
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| Project Status |
Completed (Fiscal Year 2006)
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| Budget Amount *help |
¥2,800,000 (Direct Cost: ¥2,800,000)
Fiscal Year 2006: ¥900,000 (Direct Cost: ¥900,000)
Fiscal Year 2005: ¥900,000 (Direct Cost: ¥900,000)
Fiscal Year 2004: ¥1,000,000 (Direct Cost: ¥1,000,000)
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| Keywords | 鉄ポルフィセン / 再構成 / 西洋ワサビペルオキシダーゼ / 酸化触媒活性 / 反応中間体 / 酸化触媒反応 / ペルオキシダーゼ / 過酸化水素 / ミオグロビン / 酸素錯体 |
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| Research Abstract |
本報告者は活性中心にあるヘムを人工補欠分子に置換する補欠分子再構成法によって、ヘムタンパク質の機能改変・機能向上を目指している。ヘムタンパク質の一種である西洋ワサビペルオキシダーゼ(Horseradish peroxidase, HRP)は非常に高い酸化触媒活性を有する酸化酵素である。このHRPの機能向上を試み、合成によって得られたヘムの構造異性体である鉄ポルフィセンを有する再構成HRPの構築を実施した。
実際に酸変性によってヘムを除去したアポHRPに鉄ポルフィセンを挿入し、カラムクロマトグラフィー(サイズ排除・陰イオン交換)による精製を経て鉄ポルフィセンを有する再構成HRPを得た。調製した再構成HRPと過酸化水素との反応を吸収スペクトルにより追跡したところ、2種類の中間体の生成が確認された。そのうち一つは鉄ポルフィセンのπカチオンラジカル種を示す820nm付近の吸収を有することから、oxoferryl πカチオンラジカル種であるcompound Iに相当する中間体であることが判明した。この鉄ポルフィセンのcompound Iの観測は初めての例であり、HRPタンパク質マトリックスを用いることで、穏やかな条件でその形成を確認することに成功した。またstopped-flow法により、過酸化水素存在下での2-methoxyphenolの酸化触媒反応における速度定数を評価した。その結果、compound Iにおける基質の酸化速度定数h、compound IIにおける基質の酸化速度定数k_3はともに天然HRPよりも大きく、再構成HRPにおける反応中間体の活性の高さが明らかとなった。さらにthioanisole酸化反応に対する再構成HRPの触媒活性も天然HRPの約20倍向上することが分かり、HRP内における鉄ポルフィセンの高酸化活性種の高い反応性が実証された。このように、鉄ポルフィセンを有する再構成HRPにおける反応中間体と、酸化触媒活性に対する新しい知見を得た。
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Report
(3 results)
Research Products
(3 results)
