医薬価値に優れた人工蛋白質の創製とその薬物治療の最適化・システムへの展開

• Project/Area Number: 04J08476
• Research Category: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• Allocation Type: Single-year Grants
• Section: 国内
• Research Field: Medical pharmacy
• Research Institution: Osaka University
• Research Fellow: 向 洋平 大阪大学, 大学院薬学研究科, 特別研究員(DC1)
• Project Period (FY): 2004 – 2006
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2006)
• Budget Amount: ¥2,800,000 (Direct Cost: ¥2,800,000); Fiscal Year 2006: ¥900,000 (Direct Cost: ¥900,000); Fiscal Year 2005: ¥900,000 (Direct Cost: ¥900,000); Fiscal Year 2004: ¥1,000,000 (Direct Cost: ¥1,000,000)
• Keywords: ファージ表面提示法 / mutein / TNF(腫瘍壊死因子) / X線結晶構造解析 / 抗体ライブラリ / ペプチドライブラリ / Bioconjugation / 一本鎖抗体(scFv)

Research Abstract

蛋白質による疾病治療は、がんに対する抗体療法、ウィルス感染に対するサイトカイン療法の世界的な進展に伴って、更なる蛋白質製剤の開発への期待が加速度的に増している。これまでに私は、蛋白性医薬品による疾病治療(蛋白療法)の最適化を目指し、独自のファージ表面提示法(phage display system)を駆使することで、医薬価値に優れた様々な機能性蛋白質を創製してきた。本年度はこれらファージ表面提示法を多種類の蛋白質へ展開するために、抗体ライブラリ・ペプチドライブラリを用いた検討を行った。抗体ライブラリに関しては、既存のライブラリよりも質の高い抗体ライブラリ作製法の確立をはじめ、各種ファージ抗体ライブラリに関する基礎情報の集積を行い(Biol Pharm Bull 2006、Pharmazie in press)、現存するファージ表面提示法をさらにステップアップ可能な方法論を提唱した。ペプチドライブラリに関しては、従来までターゲットとの結合親和性を有するペプチドを単離するのみにとどまっていたファージペプチドライブラリの応用範囲をさらに拡大し、細胞内へと侵入する機能を有するペプチド(Protein transduction domain ; PTD)の創製へと応用可能なファージペプチドライブラリを駆使した新規PTDのスクリーニング法を考案した(Biol Pharm Bull in press、Blochem Biophys Res Commun 2006)。
さらには一方で、昨年度から引き続き、これまで我々が開発した、機能性治療用サイトカインであるLys欠損TNF変異体;KO(Nat.Biotechnol 2003)とそのレセプターとの複合体を作製し、そのX線結晶構造解析を行っている。現状では、これらのX線データを2.9A分解能にて収集することに成功しており、その構造精密化のステップへと進んでいる。さらには様々な機能を有する(レセプター選択性を有する、活性増強変異体など)変異体単独の構造解析も行っており、現在複数の変異体(レセプター選択性を有するアゴニスト、あるいは結合するが活性を示さないアンタゴニストなど)の結晶構造を得ている。このような構造情報の集積は、今まで私が作製してきた変異体の「機能」と「構造」の連関を解明するものであり、例えば今後の医薬品として有用なターゲットに対する高い特異性を有した低分子アンタゴニストなどの設計も可能とするであろう。本方法論は、将来的に、疾患関連蛋白質に対する効果的治療法の確立における基盤技術となることを期待している。

Research Products

• [Journal Article] Quality enhancement of the non-immune phage scFv library to isolate effective antibodies. (2006)
  • Author(s): Imai S, Mukai Y, Nagano K, Shibata H, Sugita T, Abe Y, Nomura T, Tsutsumi Y, Kamada H, Nakagawa S, Tsunoda S.
  • Journal Title: Biol Pharm Bull. 29(7) Pages: 1325-1330
• [Journal Article] A novel method for construction of gene fragment library to searching epitopes. (2006)
  • Author(s): Kawamura M, Shibata H, Okamoto T, Mukai Y, Sugita T, Abe Y, Imai S, Nomura T, Nagano K, Mayumi T, Nakagawa S, Tsutsumi Y, Tsunoda S, Kamada H.
  • Journal Title: Biochem Biophys Res Commun 346(1) Pages: 198-204
• [Journal Article] Phage display and PEGylation of therapeutic proteins. (2005)
  • Author(s): Mukai Y, Yoshioka Y, Tsutsumi Y.
  • Journal Title: Comb Chem High Throughput Screen 8(2) Pages: 145-152
• [Journal Article] Phage display and PEGylation of therapeutic proteins. (2005)
  • Author(s): Mukai Y, Yoshioka Y, Tsutsumi Y.
  • Journal Title: Comb Chem High Throughput Screen. 8(2) Pages: 145-152
• [Journal Article] Functionalization of tumor necrosis factor-alpha using phage display technique and PEGylation improves its antitumor therapeutic window. (2004)
  • Author(s): Shibata H, Yoshioka Y, Ikemizu S, Kobayashi K, Yamamoto Y, Mukai Y, Okamto T, Taniai M, Kawamura M, Abe Y, Nakagawa S, Hayakawa T, Nagata S, Yamagata Y, Mayumi T, Kamada H, Tsutsumi Y.
  • Journal Title: Clin Cancer Res. 10(24) Pages: 8293-8300
• [Journal Article] Optimal construction of non-immune scFv phage display libraries from mouse bone marrow and spleen established to select specific scFvs efficiently binding to antigen. (2004)
  • Author(s): Okamoto T, Mukai Y, Yoshida Y, Shibata H, Kawamura M, Yamamoto Y, Nakagawa S, Kamada H, Hayakawa T, Mayumi T, Tsutsumi Y.
  • Journal Title: Biochem Biophys Res Commun. 323(2) Pages: 583-591
• [Journal Article] Design of a pH-sensitive polymeric carrier for drug release and its application in cancer therapy. (2004)
  • Author(s): Kamada H, Tsutsumi Y, Yoshioka Y, Yamamoto Y, Kodaira H, Tsunoda S, Okamoto T, Mukai Y, Shibata H, Nakagawa S, Mayumi T.
  • Journal Title: Clin Cancer Res. 10(7) Pages: 2545-2550
• [Journal Article] Effective accumulation of poly(vinylpyrrolidone-co-vinyl laurate) into the spleen. (2004)
  • Author(s): Yoshioka Y, Tsutsumi Y, Mukai Y, Shibata H, Okamoto T, Kaneda Y, Tsunoda S, Kamada H, Koizunri K, Yamamoto Y, Mu Y, Kodaira H, Sato-Kamada K, Nakagawa S, Mayumi T.
  • Journal Title: J Biomed Mater Res A. 70(2) Pages: 219-223
• [Journal Article] Creation of novel protein transduction domains (PTDs) under phage display system-based high-throughput screening methods.
  • Author(s): Mukai Y, Sugita T, Yamato T, Yamanada N, Shibata H, Imai S, Abe Y, Nagano K, Nomura T, Kamada H, Nakagawa S, Tsutsumi Y, Tsunoda S.
  • Journal Title: Biol Pharm Bull (in press)
• [Journal Article] Optimization of anti-tumor necrosis factor-α single chain Fv displayed on phages for creation of functional antibodies.
  • Author(s): Mukai Y, Okamoto T, Kawamura M, Shibata H, Sugita T, Imai S, Abe Y, Nagano K, Nomura T, Kamada H, Tsutsumi Y, Mayumi T, Nakagawa S, Tsunoda S.
  • Journal Title: Pharmazie (in press)
• [Journal Article] Bioconjugation of proteins with polymeric modifiers for improvement of their therapeutic efficacy.
  • Author(s): Mukai Y, Tsutsumi Y, Yoshioka Y, Mayumi T
  • Journal Title: Curr.Topics in Peptide & Protein Research (In press)
• [Book] Bioベンチャー vol.4 No.6 (2004)
  • Author(s): 向 洋平, 堤 康央
  • Total Pages: 4
  • Publisher: 羊土社