複数のキナーゼ活性を同時観察可能な蛍光プローブ分子の開発と細胞周期解析への応用

Research Project

Project/Area Number	04J11499
Research Category	Grant-in-Aid for JSPS Fellows
Allocation Type	Single-year Grants
Section	国内
Research Field	Analytical chemistry
Research Institution	The University of Tokyo
Principal Investigator	河合康俊東京大学, 大学院理学系研究科, 特別研究員(DC1)
Project Period (FY)	2004 – 2006
Project Status	Completed (Fiscal Year 2006)
Budget Amount *help	¥2,800,000 (Direct Cost: ¥2,800,000) Fiscal Year 2006: ¥900,000 (Direct Cost: ¥900,000) Fiscal Year 2005: ¥900,000 (Direct Cost: ¥900,000) Fiscal Year 2004: ¥1,000,000 (Direct Cost: ¥1,000,000)
Keywords	蛍光プローブ / 蛍光共鳴エネルギー移動 / 緑色蛍光タンパク質 / MAPキナーゼ / Erk / タンパク質リン酸化 / 可視化 / FRET
Research Abstract	ERKは増殖因子や発癌プロモーターなどの細胞外刺激で活性化されるセリン/スレオニンキナーゼである.本研究ではERKのキナーゼ活性を蛍光顕微鏡観察下の細胞内で可視化分析するための新規蛍光プローブの開発を行い,ERK情報伝達系における新たな知見の獲得を目指した.このプローブは,ERKのリン酸化標的基質ペプチドである基質ドメイン,リン酸化された基質ドメインと結合するFHA2ドメイン,および2色の蛍光タンパク質(CFP, YFP)から構成されており,活性化ERKによってリン酸化された基質ドメインがFHA2ドメインと結合することによってCFP-YFP間の蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)効率が変化することを期待してプローブを設計した.プローブをコードするcDNAをヒト乳癌由来MCF-7細胞に導入し,上皮増殖因子(EGF)を添加したところ,プローブ分子のリン酸化に伴うFRET効率の減少が観察された.ウエスタンブロッティング法によりプローブの基質ドメインがリン酸化されていること,また,ERKの活性化を阻害する薬剤U0126の存在下ではFRET効率の減少,基質ドメインのリン酸化ともに観察されないことから,このプローブはERKの活性化を生細胞内で検出可能であることが確認された.また,プローブの応答から,細胞質ではEGF添加後のERK活性の上昇が一過的であるのに対し,核内では活性が持続的であることを見出した.チロシン脱リン酸化を阻害するオルトバナジン酸ナトリウムの存在下では細胞質におけるERKの活性が持続的になったことから,EGF刺激によって活性化されたERKを脱リン酸化して不活性化するチロシンポスファターゼが細胞質にのみ存在していることが明らかとなった.本研究は,蛍光標識によるERKの分子動態解析ではなし得なかった,ERKの「活性」の時間的・空間的な解析に蛍光プローブが有用であることを示した.