ゲノム・テキストの維持と再編に関わるタンパク質の解析

Research Project

Project/Area Number	04J54071
Research Category	Grant-in-Aid for JSPS Fellows
Allocation Type	Single-year Grants
Section	国内
Research Field	Genetics/Genome dynamics
Research Institution	The University of Tokyo
Principal Investigator	渡部美紀東京大学, 大学院・新領域創成科学研究科, 特別研究員(DC2)
Project Period (FY)	2004 – 2005
Project Status	Completed (Fiscal Year 2005)
Budget Amount *help	¥1,900,000 (Direct Cost: ¥1,900,000) Fiscal Year 2005: ¥900,000 (Direct Cost: ¥900,000) Fiscal Year 2004: ¥1,000,000 (Direct Cost: ¥1,000,000)
Keywords	超好熱菌 / 制限酵素 / 修飾酵素
Research Abstract	<目的> II型の制限酵素は、特定の短い認識配列においてDNAの2重鎖切断を起こす。一方、修飾酵素は、メチル化によってその認識配列を保護する。制限酵素遺伝子(r)と修飾酵素遺伝子(m)とは隣接している。本研究は、小麦胚芽無細胞タンパク質合成系を用いた超好熱菌のII型制限酵素の大量発現をもとに、その構造解析を行い、制限酵素が特定塩基配列を認識するメカニズムや、DNA2重鎖切断を起こす機構を解明することを目的としている。また、今回対象とした超好熱菌pyroccocus abyssiのII型制限酵素は、既知の制限酵素ファミリーとは異なる新規の構造を持つことが予想されており、構造ゲノム比較といった分野へつながることも予想される。同時に、隣接している修飾酵素の発現・機能解析を行うことで、超好熱菌Pyroccocus abyssiの制限修飾酵素系を理解することも目的としている <結果> 制限酵素を、小麦胚芽無細胞タンパク合成系を用いて大量発現(共同研究)させ、結晶化を行った。その結果、分解能3Å程度の結晶を得ることができた。更に、小麦胚芽無細胞タンパク合成系にセレノメチオニン導入し結晶化を行い、分解能3Å程度の結晶を得ることができ、これらの結果から、構造解析(共同研究)を行い、構造が明らかとなった。制限酵素に隣接するDNA修飾酵素の機能解析を行うために、大腸菌を用いた大量発現・精製を行い、その生化学的解析を行った。その結果、配列特異的メチル化酵素であることが明らかとなった。また、この修飾酵素の反応至適条件(温度、pH、塩濃度、二価金属の効果)を明らかにした。加えて、熱力学的パラメーター及び、速度論的パラメーターと求めた。これらの結果から、今回解析を行ったDNA修飾酵素は、これまで報告されているDNA修飾酵素のなかで最も耐熱性をしめす酵素であることも明らかとした。