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ハプト藻の脂肪酸Δ3不飽和化酵素の特性と同遺伝子のクローニング

Research Project

Project/Area Number 05266201
Research Category

Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas

Allocation TypeSingle-year Grants
Research InstitutionHokkaido University

Principal Investigator

奥山 英登志  北海道大学, 大学院・地球環境科学研究科, 助教授 (90125295)

Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) 石川 鑛  北海道大学, 大学院・地球環境科学研究科, 教授 (80000834)
Project Period (FY) 1993
Project Status Completed (Fiscal Year 1993)
Budget Amount *help
¥1,500,000 (Direct Cost: ¥1,500,000)
Fiscal Year 1993: ¥1,500,000 (Direct Cost: ¥1,500,000)
Keywordsハプト藻 / 脂肪酸不飽和化酵素 / 不飽和脂肪酸
Research Abstract

本研究ではハプト藻B株Δ3不飽和化酵素遺伝子のクローニングを中心課題として行った。
[方法](1)ゲノミックサザン法:ハプト藻B株の核DNAを各種制限酵素で消化し、シロイヌナズナのΔ15不飽和化酵素遺伝子に由来する、ECLによる蛍光ラベルをしたDNA断片(クローン296、302)をプローブとしてサザン法を行った。(2)ゲノムDNAを鋳型とするPCR法:B株の全DNAを鋳型とし、シロイヌナズナのΔ15不飽和化酵素遺伝子に由来する数種類のDNA断片を適宜組み合わせたものをプライマーとしてPCRを行った。PCR産物を電気泳動し、クローン296、302をプローブに用いてサザン法を行った。ポジティブクローンは大腸菌で増幅し、オートシケンサーを用いて塩基配列を決定した。(3)cDNAを鋳型とするPCR法:B株よりmRNAを調製した後、cDNAを合成した。cDNAを鋳型、(2)で用いたDNA断片をプライマーとしてPCRを行った。PCR産物に対しクローン296、302をプローブとしてサザン法を行った。
[結果](1)ゲノミックサザン法:各種制限酵素産物のいずれもがクローン296、302とも相補性を示さなかった。(2)ゲノムDNAを鋳型とするPCR法:PCR産物とクローン296、302とのサザン法により、2つのポジティブクローン(クローン26、27)を得た。これらをBluescriptを用いた系によりサブクローニングし、得られた6クローンをオートシーケンサーにかけた。最終的に既知の不飽和化酵素遺伝子群とのホモロジー検索に供することができたのは1クローン(クローン26C)であり、そのΔ15不飽和化酵素遺伝子とのホモロジーは30%以下であった。
(3)cDNAを鋳型とするPCR法:B株のライフサイクルを通じて18:5ω3のレベルの最も高い時期の細胞から調製したpoly(A)^+RNAからcDNAを合成した。このcDNAを鋳型としてPCRを行った。クローン296とクローン302をプローブとしてPCR産物のサザン法を行ったところ、9個のポジティブクローンが得られた。今これらのクローンのシーケンスを行っている。

Report

(1 results)
  • 1993 Annual Research Report

URL: 

Published: 1993-04-01   Modified: 2016-04-21  

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