正常1番染色体移入細胞を用いた大腸癌抑制遺伝子の検索

Research Project

Project/Area Number	05670214
Research Category	Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
Allocation Type	Single-year Grants
Research Field	Experimental pathology
Research Institution	Tokyo Metropolitan Organization for Medical Research
Principal Investigator	田中貴代子財団法人東京都臨床医学総合研究所, 腫瘍生化学研究部門, 研究員 (40124474)
Project Period (FY)	1993
Project Status	Completed(Fiscal Year 1993)
Budget Amount *help	¥2,000,000 (Direct Cost : ¥2,000,000) Fiscal Year 1993 : ¥2,000,000 (Direct Cost : ¥2,000,000)
Keywords	癌抑制遺伝子 / サブトラクション / 大腸癌 / 1番染色体 / 微小核融合法
Research Abstract	正常1番染色体短腕34-36領域の移入によりヌードマウスにおける造腫瘍性が抑制された移入細胞と、移入領域の一部の欠失により造腫瘍性が再発現したリバータント細胞からグアニジウムチオシアネート法により全RNAを調整し、さらにオリゴ(dT)セルロースカラムによりポリA付加mRNAを調整した。リバータント細胞から調整したmRNAをologotex-dT30にアニールし、(dT)_<30>をプライマー、mRNAを鋳型としてAMV逆転写酵素によりologotex-dT30上でcDNAを合成した。熱変性後遠心により上清画分のmRNAを除き沈殿画分のcDNA-oligotex-dT30に正常1番染色体移入細胞から調整したmRNAを加えハイブリッドを形成させ、遠心によりcDNA-oligotex-dT30とハイブリッドを形成した共通のmRNAを除いた。この繰り返しにより濃縮した1番染色体移入細胞特異的mRNAを鋳型として、XbaIプライマー-アダプターを用いて1本鎖cDNAを合成し、大腸菌RNaseHとDNAポリメラーゼIにより2本鎖cDNAを合成した。SalIアダプターを付加した後XbaIで消化してBluescriptIIのクローニング部位に挿入し、大腸菌にトランスフェクトしてライブラリーを作製した。現在移入細胞とリバータントのcDNAをプローブにしてデファレンシャルハイブリダイゼーションを行い1番染色体移入細胞に特異的な遺伝子クローンの選別を行っている。