無細胞DNA複製再開系を用いた損傷DNAの複製フォーク後退メカニズムの解析
Project/Area Number |
05J00870
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Research Category |
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
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Allocation Type | Single-year Grants |
Section | 国内 |
Research Field |
Risk sciences of radiation/Chemicals
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Research Institution | Osaka University |
Principal Investigator |
菅野 毅治 Osaka University, 生命機能研究科, 特別研究員(DC1)
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Project Period (FY) |
2005 – 2007
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Project Status |
Completed (Fiscal Year 2007)
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Budget Amount *help |
¥2,800,000 (Direct Cost: ¥2,800,000)
Fiscal Year 2007: ¥900,000 (Direct Cost: ¥900,000)
Fiscal Year 2006: ¥900,000 (Direct Cost: ¥900,000)
Fiscal Year 2005: ¥1,000,000 (Direct Cost: ¥1,000,000)
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Keywords | DNA複製 / 複製フォーク後退 / DNA損傷 / 複製中間体 / 二次元アガロースゲル電気泳動 / WRN / BLM / RECQ5β / 原子間力顕微鏡 / RecQ5B |
Research Abstract |
本研究では、DNA損傷などにより進行を阻害された複製フォークがDNA複製を再開する機構のひとつと考えられる複製フォーク後退機構を明らかにすることを目的としている。本年度は昨年度までに確立した試験管内無細胞DNA複製再開系を用いて、引き続き以下の解析を行った。 まず、昨年度までに検出できていた損傷誘発的な異常な構造の複製中間体をより詳細に解析する為に、二次元アガロースゲル電気泳動法によって分離した複製中間体をSouthern blottingによって解析した。複数の部位及びDNA鎖特異的なプローブを用いて検出を行った結果、紫外線DNA損傷であるcyclobutane pyrimidinedimer (CPD)と6-4光産物(6-4PP)が複製フォークの進行を阻害した場合に、replication uncouplingが引き起こされ、複数種の異常な構造の複製中間体を形成することがわかった。また、そのうちのいくつかが、複製フォーク後退機構に特徴的なチキンフット中間体であることが示唆された。 次に、複製フォーク後退機構に深く関与すると考えられているRecQ helicaseのWRN、BLM、RECQ5βの組み換えタンパク質を作成し、精製した。精製した組み換えタンパク質を、試験管内反応系に添加し、それらが複製中間体に与える影響を二次元アガロースゲル電気泳動法で解析した。その結果、これらの組み換えタンパク質は、CPDと6-4PPによって誘発される異常な構造の複製中間体には顕著な影響を及ぼさなかったが、複製中のDNAのねじれの解消を促進することが示唆された。 以上、一連の結果は、国際学術雑誌に投稿するために、現在準備中である。
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Report
(3 results)
Research Products
(2 results)