消化器癌の発生に関わるヘッジホッグ経路のエピジェネティクな制御機構の解析

Research Project

Project/Area Number	05J05135
Research Category	Grant-in-Aid for JSPS Fellows
Allocation Type	Single-year Grants
Section	国内
Research Field	Digestive surgery
Research Institution	Kumamoto University
Principal Investigator	渡邉すぎ子熊本大学, 大学院医学薬学研究部, 特別研究員(PD)
Project Period (FY)	2005
Project Status	Completed (Fiscal Year 2005)
Budget Amount *help	¥1,100,000 (Direct Cost: ¥1,100,000) Fiscal Year 2005: ¥1,100,000 (Direct Cost: ¥1,100,000)
Keywords	消化器癌 / Sonic Hedgehog / 遺伝子 / 発現制御 / クロマチン / 発生分化
Research Abstract	1)消化器癌細胞株におけるSonic Hedgehog ; ShhおよびShhシグナル経路の発現検討 RT-PCRによりShhおよびShhシグナル分子のmRNAを、またShhに対する特異的抗体を用いたWestern blot法および免疫染色法によりタンパク質の発現を解析したところ、多くの細胞株でShhやそのシグナル経路の発現を認めた。 2)Shh過剰発現による細胞制御機構の解析 ShhをPCR法にてクローニングし、Shh発現ベクターを作成した。各種消化器癌細胞株にShh発現ベクターを遺伝子導入し、細胞形態や細胞増殖能の変化を観察したところ、明らかな変化は認められなかった。 3)Shhのプロモーター領域の解析 Shhのプロモーター領域の配列をゲノムよりPCR法にてクローニングした。消化器癌にて高発現がみられるクロマチン結合因子のShhプロモーターへの結合性を、in vitroにおいてバンドシフト法で、in vivoにおいてクロマチン免疫沈降で検出した。またShhのプロモーター領域を含むルシフェラーゼベクターを作成し、ルシフェラーゼアッセイによりそのプロモーター活性を検出した。 4)クロマチン結合因子とShh発現量の関連性消化器癌細胞株においてクロマチン結合因子をsiRNA導入によりノックダウンし、特異的抗体を用いたWestern blot法によりそのノックダウン効果を定量した。さらにクロマチン結合因子ノックダウンによるShh発現量の変化をreal time RT-PCRや特異的抗体を用いたWestern blot法により定量したところ一部に変化がみられた。