培養によらない微生物の機能解明-シングルセルレベルでの機能遺伝子検出技術の開発-
Project/Area Number |
05J05464
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Research Category |
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
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Allocation Type | Single-year Grants |
Section | 国内 |
Research Field |
Civil and environmental engineering
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Research Institution | Nagaoka University of Technology |
Principal Investigator |
久保田 健吾 長岡技術科学大学, 工学部, 特別研究員(PD)
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Project Period (FY) |
2005 – 2006
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Project Status |
Completed (Fiscal Year 2006)
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Budget Amount *help |
¥1,800,000 (Direct Cost: ¥1,800,000)
Fiscal Year 2006: ¥900,000 (Direct Cost: ¥900,000)
Fiscal Year 2005: ¥900,000 (Direct Cost: ¥900,000)
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Keywords | Fluoresccnce in situ hybridization / locked nucleic acid / tyramide signal amplification / メタン生成古細菌 / プローブ交雑効率 / Fluorescence in situ hybridization / Tyramide signal amplification / mRNA / two-pass TSA-FISH法 |
Research Abstract |
Fluorescence in situ hybridization (FISH)法は、培養によらず特定微生物を特異的に検出できる。特にrRNAを標的としたFISH法は、rRNA遺伝子配列に基づいた分子系統学的同定が可能なことから広く用いられている。しかしながらrRNA遺伝子情報からは、微生物の機能に関する知見を得ることは難しい。そのため、ある特定の反応(微生物機能)に関与しているタンパク質をコードしている遺伝子配列をもとに検出することは非常に有用である。しかし遺伝子の検出には蛍光標識プローブは感度が不十分で、検出は困難である。そこで本研究では、培養によらずに微生物の機能を解明するためのツールとして、two-pass tyramide signal amplification (TSA)-FISH法に着目し、本技術を用いて遺伝子配列に基づいた検出が可能か検討を行った。プローブはPCR法を用いてハプテン標識したものを作成した。プローブ作成の際にはハプテンをより多く取り込み、かつより多くの収量が得られるよう実験条件を最適化した。作成したプローブとtwo-pass TSA-FISH法を適用する事で、原核生物を遺伝子配列に基づいて同定する事に成功した。しかし、若干特異性に問題があるため、更なる検討が必要である。 次に、プローブを標的分子に効率的に交雑させる方法について検討を行った。これは、例えばrRNAを標的としたプローブを設計した場合、プローブ配列やrRNAの高次構造によりプローブがrRNAにうまく交雑しないと言った現象が、特異的プローブを設計する際の問題となっているためである。本研究では、人工核酸のlocked nucleic acid (LNA)に着目し、LNAをDNAプローブの中に数カ所挿入する事で、プローブの交雑効率を著しく改善する事が加納である事を明らかにした。またプローブの乖離温度とプローブの交雑効率の間に関係を見いだし、高交雑効率を得るために必要なプローブの乖離温度についても提案した。
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Report
(2 results)
Research Products
(8 results)