| Project/Area Number |
05J11328
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| Research Category |
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Section | 国内 |
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| Research Field |
Chemistry related to living body
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
北村 佳仁 東京大学, 先端科学技術研究センター, 特別研究員(PD)
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| Project Period (FY) |
2005 – 2006
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| Project Status |
Completed (Fiscal Year 2006)
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| Budget Amount *help |
¥1,800,000 (Direct Cost: ¥1,800,000)
Fiscal Year 2006: ¥900,000 (Direct Cost: ¥900,000)
Fiscal Year 2005: ¥900,000 (Direct Cost: ¥900,000)
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| Keywords | DNA / 遺伝子組み換え / セリウム(IV) / 加水分解 / バキュロウイルス / 位置選択的切断 / GFP / BFP |
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| Research Abstract |
我々は、これまでにCe(IV)/EDTAが二本鎖DNAに比べて一本鎖DNAを遥かに効率よく加水分解することを報告している。また、この気質特異性とPNAが二本鎖DNAに塩基配列特異的にインベーションすることを利用して、二本鎖DNAを望みの位置で特異的に切断することに成功している。この人工制限酵素(ARCUT)によるDNAの位置特異的切断を利用して、プラスミドDNAを遺伝子操作することによりキメラタンパクを構築することもできる。本研究では、プラスミドDNAよりもさらに巨大なバキュウロウイルスゲノム(130kb)を目的の位置で特異的に切断することを試みた。
バキュウロウイルスゲノムは、pBR322プラスミドDNAの切断ターゲットとしていた配列を、Bac-to-Bac法によりバクミド内に組み込み、ターゲット配列を有するバキュウロウイルスゲノムを得た。ARCUTによる切断実験では、バキュウロウイルスゲノムにPNAを加え、50℃で3hインキュベートした後、Ce(IV)/EDTAを加えて切断反応を行った(37℃、48h)。切断反応後、EDTPOにより切断反応を停止し、EcoRVにより酵素処理を行った。これにより、目的の位置でバキュウロウイルスゲノムが切断されている場合には1.3kbpのDNAバンドが確認できる。切断の評価は電気泳動後、サザンブロッドで行った。
その結果、末端にリン酸基を有しないPNAを使用した場合には、目的位置での切断が確認できないのに対し、末端にリン酸基を有するPNAを使用すること、目的位置に特異的に切断することができた。以上より、バキュロウイルスゲノムのような巨大DNAであっても、本研究のARCUTは有効に働くことが示された。
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