Budget Amount *help |
¥1,900,000 (Direct Cost: ¥1,900,000)
Fiscal Year 2007: ¥900,000 (Direct Cost: ¥900,000)
Fiscal Year 2006: ¥1,000,000 (Direct Cost: ¥1,000,000)
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Research Abstract |
Ochrobactrum sp.由来ピリドキサール4-デヒドロゲナーゼ(oPLDH)は一次構造上,アルド-ケトレダクターゼ(AKR)スーパーファミリーに属する.しかしながら,不可逆的な酸化反応のみを触媒すること,またNAD^+に対して非常に高い親和性を有するといった他のAKR酵素とは異なる特徴を有していることから,立体構造的に非常に興味深い酵素である.また,Mesorhizobium loti由来PLDH(6807-PLDH)は基質特異性が非常に高く,ピリドキサールのみを基質とし,触媒効率はoPLDHの約900倍である.本年度はこれら酵素の反応機構を解明することを目的とし,結晶化および構造解析を試みた. これまでoPLDHの結晶を用いて,2.0Å分解能までのX線回折データを得ることに成功したが,位相の決定には至っていない.そこで,本酵素のセレノメチオニン置換タンパク質発現系を構築した.作製した発現系から精製酵素を用いて,結晶化を行ったが,解析可能な結晶を得ることができなかった.次に,Native結晶を用いて重原子同型置換法を試みた.金(3種),水銀(3種),プラチナ(2種),ヨウ素(2種),サマリウム(1種),イリジウム(1種)などさまざまな重原子試薬を用い,重原子誘導体を作製した.また,結晶化条件のスクリーニングも再度行い,ヨウ素を含む緩衝液で良好な結晶を得ることができた.現在これら重原子置換した結晶の解析を進めている.6807-PLDHを各種カラムクロマトグラフィーにより精製し,結晶化スクリーニングを行った.結晶化条件の探索の結果,数条件で本酵素の結晶が得られたが,構造決定に十分な分解能のX線回折像を得ることはできなかった.現在更なる結晶化条件の探索を試みている.
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