リンゴの褐変の機構とその制御:リンゴポリフェノールオキシダーゼの構造と発現機構について

• Project/Area Number: 07660157
• Research Category: Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Research Field: 食品科学・栄養科学
• Research Institution: Ochanomizu University
• Principal Investigator: 村田 容常 お茶の水女子大学, 生活科学部, 助教授 (60210051)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 本間 清一 お茶の水女子大学, 生活科学部, 教授 (50017240)
• Project Period (FY): 1995
• Project Status: Completed (Fiscal Year 1995)
• Budget Amount: ¥2,000,000 (Direct Cost: ¥2,000,000); Fiscal Year 1995: ¥2,000,000 (Direct Cost: ¥2,000,000)
• Keywords: リンゴ / 酵素的褐変 / ポリフェノールオキシダーゼ / クローニング / PCR

Research Abstract

リンゴを切ると褐変することはよく知られた現象で、酵素的褐変の典型例である。これは、リンゴ細胞中のポリフェノール類がポリフェノールオキシダーゼ(PPO)により酸化されキノン体となり、それがさらに重合するためと考えられている。リンゴPPOは、我々により1992年に初めて単離された。抗PPO抗体を調整し、PPOのリンゴ組織内分布を検討したところ、PPOはリンゴ果実の中心付近(種子の回り)に局在することがわかり、これが褐変部位と一致した。このようにリンゴPPOは、リンゴの褐変に中心的役割をはたすが、構造と活性の詳細は未詳であり、また、その発現を制御することにより褐変をコントロールすることも試みられていない。そこで申請者は、まずリンゴPPO遺伝子をクローニングし、その構造を明らかにすることとした。リンゴPPOをコードすると予想されるプライマーを用い、PCR法によりゲノムDNAを増輻した。その結果、PPO遺伝子と思われるバンドが検出された。増輻断片をpBluescriptに組み込み、大腸菌に導入した。得られた十数個のコロニーの遺伝子を調べたところ2個のPPO遺伝子を得ることができた。各々をシークエンスし、全塩基配列を決定し、アミノ酸配列に翻訳した。その結果、リンゴPPO遺伝子にはイントロンがないこと、シグナルシークエンスよりPPOタンパク質はプラスチドへ輸送されること、銅2分子が結合すると予想される保存性の高い2つの活性中心領域(Cu-A、Cu-B)が存在すること等が明らかとなった。さらに本遺伝子の大腸菌中での発現に成功した。発現タンパク質はPPO活性を有し、かつ抗リンゴPPO抗体と反応した。

Research Products

• [Publications] 春田美好,村田容常,本間清一: "リンゴポリフェノール酸化酵素遺伝子のクローニングと解析" 日本農芸化学会誌7U巻臨時増刊号. 70. 91 (1996)