ポストゲノム時代の挑戦:ABCG2タンパク質の品質管理と小胞体ストレス

• Project/Area Number: 07J05897
• Research Category: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• Allocation Type: Single-year Grants
• Section: 国内
• Research Field: Chemistry related to living body
• Research Institution: Tokyo Institute of Technology
• Principal Investigator: 中尾 香菜子 (若林 香菜子) Tokyo Institute of Technology, 大学院・生命理工学研究科, 特別研究員(DC1)
• Project Period (FY): 2007 – 2009
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2009)
• Budget Amount: ¥2,800,000 (Direct Cost: ¥2,800,000); Fiscal Year 2009: ¥900,000 (Direct Cost: ¥900,000); Fiscal Year 2008: ¥900,000 (Direct Cost: ¥900,000); Fiscal Year 2007: ¥1,000,000 (Direct Cost: ¥1,000,000)
• Keywords: 多剤耐性 / ABCトランスポーター / ABCG2 / 小胞体ストレス / ユビキチン化 / タンパク質品質管理機構

Research Abstract

本研究ではガン細胞における多剤耐性の要因として注目されてきたABCG2を膜タンパク質のモデルとして、糖鎖付加、ジスルフィド結合、ユビキチン化に代表される翻訳後修飾とタンパク質の品質管理、細胞内安定性との関係を解明しそれを制御する分子プローブを設計することを目的としている。最終年度となる本年は以下の2点に焦点をあてた。
(1)ABCG2タンパク質の品質管理と分解経路機構
ABCG2タンパク質の第3番目の細胞外ループに存在する2つのCys残基(Cys592,Cys608)は、ABCG2のタンパク質としての安定性を維持する上で重要である。それらのCys残基が欠損すると、分子内S-S結合が形成されず、タンパク質としての構造が不安定化し、未成熟タンパク質としてユビキチン・プロテアソーム系で分解されてしまう。また実際ヒトからみつかっている2つの一塩基多型(F208S,S441N)でも前述の変異体と同様のメカニズムで分解されるため、発現量減少を引き起こすことも明らかとなった。そこでさらなる検証を行うため、電子顕微鏡法により、細胞内の状態の観察を行った。その結果、プロテアソーム阻害剤MG132処理を行った変異型ABCG2発現細胞では、細胞内にアグリソームと呼ばれる凝集体を観察することができた。さらにABCG2特異的な抗体を用いて、免疫電子顕微鏡法による観察を行ったところ、アグリソーム内にABCG2陽性反応が確認された。
(2)イオントラップ型質量分析器を用いたプロテオーム解析
ABCG2は小胞体内で様々なシャペロンタンパク質の助けを借りてS-S結合形成や糖鎖付加が起こり、高次構造が形成される。また未成熟タンパク質として分解されるか、成熟タンパク質としてゴルジ体へと輸送されるかの選別も小胞体で受けており、その選別にもシャペロンタンパク質が関与しているようである。そこで、イオントラップ型質量分析器を用い、ABCG2と相互作用するシャペロンタンパク質の探索を行った。変異型ABCG2として、S-S結合や糖鎖を欠損する変異体および発現量が減少する一塩基多型を用いている。その結果、変異型に特異的に結合しているシャペロンタンパク質がいくつか検出された。

Research Products

• [Journal Article] Production of cells with targeted integration of gene variants of human ABC transporter for stable and regulated expression using the Flp recom binase system (2010)
  • Author(s): Wakabayashi-Nakao K, Tamura A, Koshiba S, Nakagawa H, Ishikawa T.
  • Journal Title: Methods Mol.Biol. (In press)
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Disruption of N-linked glycosylation enhances ubiquitin-mediated proteasomal degradation of the human ATP-binding cassette transporter ABCG2 (2009)
  • Author(s): Nakagawa H, Wakabayashi-Nakao K, Tamura A, Toyoda Y, Koshiba S, Ishikawa T.
  • Journal Title: FEBS J. 276(24) Pages: 7237-7252
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Major SNP (Q141K) variant of human ABC transporter A BCG2 undergoes lysosomal and proteasomal degradations (2009)
  • Author(s): Furukawa T, Wakabayashi K, Tamura A, Nakagawa H, Morishima Y, Osawa Y, Ishikawa T.
  • Journal Title: Pharm Res 26(2) Pages: 469-479
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Quality control of human ABCG2 protein in the endoplasmic reticulum : ubiquitination and proteasomal degradation (2009)
  • Author(s): Wakabayashi-Nakao K, Tamura A, Furukawa T, Nakagawa H, Ishikawa T.
  • Journal Title: Adv. Drug Deliv. Rev. 61(1) Pages: 66-72
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Human ABC transporters ABCG2 (BCRP) and ABCG4 (2008)
  • Author(s): Koshiba S, An R, Saito H, Wakabayashi K, Tamura A, Ishikawa T.
  • Journal Title: Xenobiotica 38(7-8) Pages: 863-888
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Ubiquitin-mediated proteasomal degradation of non-synonymous SNP variants of human ABC transporter ABCG2 (2008)
  • Author(s): Nakagawa H, Tamura A, Wakabayashi K, Hoshijima K, Komada M, Yoshida T, Kometani S, Matsubara T, Mikuriya K, Ishikawa T.
  • Journal Title: Biochem.J. 411(3) Pages: 623-631
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Human ABC transporters ABCG2(BCRP)and ABCG4 (2008)
  • Author(s): Koshiba S, An R, Saito H, Wakabavashi K, Tamura A, Ishikawa T.
  • Journal Title: Xenobiotica
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Development of polyclonal antibodies specific to ATP-binding cassttetransporters human ABCG4 and mouse Abcg4:site-specific expression of mouse Abcg4 in brain (2007)
  • Author(s): Koshiba S, Ito T, Shiota A, Wakabayashi K, Ueda M, Ichinose H, Ishikawa T.
  • Journal Title: J.Exp.Ther.Oncol. 6(4) Pages: 321-333
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] In vitro evaluation of photosensitivity risk related to genetic polymorphisms of human ABC transporter ABCG2 and inhibition by drugs. (2007)
  • Author(s): Tamura A, Onishi Y, An R, Koshiba S, Wakabayashi K, Hoshijima K, Priebe W, Yoshida T, Kometani S, Matsubara T, Mikuriya K, Ishikawa T.
  • Journal Title: Drug Metab.Pharmacokin 22(6) Pages: 428-440
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] lntramolecular disulfide bond is a critical checkpoint determining degradative fates of ABC transporter ABCG2 protein (2007)
  • Author(s): Wakabayashi K, Nakagawa H, Tamura A, Koshiba S, Hoshijima K, Komada M, Ishikawa T.
  • Journal Title: J.Biol.Chem. 282(38) Pages: 27841-27846
  • Peer Reviewed
• [Presentation] The impacts of posttranslational modifications and non-synonymous SNPs on the protein stability of human ABC transporter ABCG2 protein in culture cells (2010)
  • Author(s): Nakagawa H., Wakabayashi-Nakao K., Tamura A., Koshiba S., Toyoda Y., Ishikawa T.
  • Organizer: FEBS-ABC2010-3rd FEBS Special Meeting on ABC Proteins
  • Place of Presentation: Innsbruck, Austria
• [Presentation] Monomeric non-glycosylated form of human ATP-binding cassette transporter ABCG2 is the most fragile in culture cells (2009)
  • Author(s): Nakagawa H., Wakabayashi-Nakao K., Tamura A., Koshiba S., Toyoda Y., Ishikawa T.
  • Organizer: 第32回日本分子生物学会年会
  • Place of Presentation: 横浜
  • Year and Date: 2009-12-12
• [Presentation] Placental overgrowth in mice lacking NESK, a novel Ser/Thr kinase of the Ste20 family (2009)
  • Author(s): Denda K., Nakao-Wakabayashi K., Kitamura Y., Komada M.
  • Organizer: 第32回日本分子生物学会年会
  • Place of Presentation: 横浜
  • Year and Date: 2009-12-10
• [Presentation] N-linked glycosylation stabilizes the de novo synthesized human ABC transporter ABCG2 protein (2009)
  • Author(s): Nakagawa H., Wakabayasi-Nakao K., Tamura A., Ishikawa T.
  • Organizer: 第68回日本癌学会学術総会
  • Place of Presentation: 横浜
  • Year and Date: 2009-10-03
• [Presentation] Impact of Major Non-synonymous SNP (Q141K) on Proteolysis of Human ABC Transporter ABCG2 via Lysosomal and Ubiquitin-mediated Proteasomal Degradation Pathways (2008)
  • Author(s): Furukawa T., Wakabayashi K., Tamura A., Nakagawa H., Ishikawa T.
  • Organizer: 第31回日本分子生物学会年会・第81回日本生化学会大会合同大会
  • Place of Presentation: 神戸
  • Year and Date: 2008-12-09
• [Presentation] Impact of Major Non-synonymous SNP (Q141K) on Proteolysis of Human ABC Transporter ABCG2 via Lysosomal and Ubiquitin-mediated Proteasomal Degradation Pathways (2008)
  • Author(s): Furukawa T., Wakabayashi K., Tamura A., Nakagawa H., Ishikawa T.
  • Organizer: TOIN International Symposium on Biomedical Engineering
  • Place of Presentation: 横浜
  • Year and Date: 2008-10-31
• [Presentation] Genetic polymorphisms of human ABCG2 and ER-associated degradation(ERAD)pathway (2008)
  • Author(s): Wakabayashi K, Tamura A, An R, Hoshijima K, Nakagawa H, Ishikawa T.
  • Organizer: FEBS-ABC2008-2nd FEBS Special Meeting on ABC Proteins
  • Place of Presentation: Innsbruck,Austra
• [Presentation] Disulfide Bond Formation Plays a Crucial Role in Protein Stability of Human ABCG2 (2007)
  • Author(s): Wakabayashi K, Nakagawa H, Tamura A, Hoshijima K, Komada M, Ishikawa T.
  • Organizer: 第30回日本分子生物学会年会第80回日本生化学会大会合同大会
  • Place of Presentation: 横浜
  • Year and Date: 2007-12-14
• [Presentation] Disulfide Bond Formation Plays a Crucial Role in Protein Stability of Human ABCG2 (2007)
  • Author(s): Wakabayashi K, Nakagawa H, Tamura A, Hoshijima K, Komada M, Ishikawa T.
  • Organizer: TOIN International Symposium on Biomedical Engineering
  • Place of Presentation: Yokohama
  • Year and Date: 2007-11-02
• [Presentation] Disulfide Bond Formation Plays a Crucial Role in Protein Stability of Human ABCG2 (2007)
  • Author(s): Wakabayashi K, Tamura A, Saito H, Sakurai A, Ishikawa T.
  • Organizer: 第66回日本癌学会学術総会
  • Place of Presentation: 横浜
  • Year and Date: 2007-10-04
• [Book] トランスポーター科学最前線 (2008)
  • Author(s): 辻 彰, 田村 藍, 若林 香菜子, 斉藤 光, 石川 智久, その他28名
  • Total Pages: 374
  • Publisher: 京都広川書店