カテコール体ジオキシゲナーゼの補因子にはなぜ2価鉄を3価鉄の2種があるのか

Research Project

Project/Area Number	08249217
Research Category	Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
Allocation Type	Single-year Grants
Research Institution	Shiga University of Medical Science
Principal Investigator	堀池喜八郎滋賀医科大学, 医学部, 教授 (80089870)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	石田哲夫滋賀医科大学, 医学部, 助手 (10176191)
Project Period (FY)	1996
Project Status	Completed (Fiscal Year 1996)
Budget Amount *help	¥2,000,000 (Direct Cost: ¥2,000,000) Fiscal Year 1996: ¥2,000,000 (Direct Cost: ¥2,000,000)
Keywords	カテコール / オキシゲナーゼ / 酸素添加酵素 / ジオキシゲナーゼ / 二原子酸素添加酵素 / 金属酵素 / 非ヘム鉄 / 酸素の活性化
Research Abstract	カテコール環を開裂する二原子酸素添加酵素は,intradiol型とextradiol型とに分類される.前者は補因子として非ヘムFe^<3+>を含み,各種分光法の適用が容易であるが,extradiol型酵素は補因子が非ヘムFe^<2+>であり,可視部に吸収がなく,ESRも示さず,分子論的研究が遅れている. カテコール2,3-ジオキシゲナーゼはextradiol型の酵素で,我々はPseudomonas putida mt-2由来の本酵素遺伝子を大腸菌で大量発現させ,初めて完全なホロ酵素を得た.拮抗阻害剤であるο-ニトロフェノールとの複合体の結晶は,アセトンを安定化剤とした場合の針状とは異なり,板状であった.ο-ニトロフェノールはホロ酵素にサブユニット当たり1:1で強く結合した.その吸収スペクトルはアニオン型であり,さらに長波長領域に幅広い吸収帯が出現した.複合体の共鳴ラマンで,ニトロ基の対称伸縮振動による1334cm^<-1>のピークが1328cm^<-1>へ低波数シフトした.近赤外の900nmの吸収はニトロフェノールの結合で変化しなかった.以上から,ニトロフェノールアニオンは活性部位のFe^<2+>と電荷移動錯体を形成し,その結果,電子の局在性が高まるが,d_x^2-_y^2オ-ビタルは安定なままであることが示され,extradiol型酵素ではカテコールのLUMOの重要性が示唆された. 一方,ドーパミンβ-モノオキシゲナーゼは銅依存性の一原子酸素添加酵素(4量体)であるが,低濃度DTTでサブユニット間S-S結合のみを選択的に切断できること,その際活性や4次構造には変化がないことを示した.さらにウシ副腎1個からの迅速酵素精製法を開発し,天然の変異酵素(遺伝子の多様性)を見いだした.