| Project/Area Number |
08770037
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Research Field |
General physiology
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| Research Institution | Sapporo Medical University |
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Principal Investigator |
長島 雅人 札幌医科大学, 医学部, 講師 (20264525)
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| Project Period (FY) |
1996 – 1997
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| Project Status |
Completed (Fiscal Year 1996)
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| Budget Amount *help |
¥1,000,000 (Direct Cost: ¥1,000,000)
Fiscal Year 1996: ¥1,000,000 (Direct Cost: ¥1,000,000)
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| Keywords | Na-Ca交換担体 / 胎児 / 心筋 / クローニング |
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| Research Abstract |
当初は、ラット胎児型Na-Ca交換担体遺伝子のクローニングの方法として、胎児心筋(胎生18日目)の遺伝子ライブラリーを作成し、ハイブリダイゼーションによる、クローニングを試みた。しかしながら、胎児心筋において高品質の遺伝子ライブラリーを作成することは、想像以上に難しく、この方法では、結局、目的の遺伝子を単離するまでには、至らなかった。よってRT-PCRを利用したクローニング法に変更。まず、AGPC法を用いて、胎生18日目のラットの心室筋から、mRNAを抽出し、既に報告されている。ラット(成体)のNa-Ca交換担体の遺伝子配列を基にPCRプライマーを作成、第7膜貫通部位と第11膜貫通部位の間に相当する領域にRT-PCRを施行。目的の遺伝子と思われるPCR産物をpGEM Vectorに組み込み、大腸菌に導入することで、クローン化に成功した。得られたDNAのシークエンスをダイデオキシン法を用いて行ったところ、この領域においては、塩基レベルでの遺伝子変異は、いくつか認められるものの、アミノ酸レベルの変異は、認められなかった。
現在地の部位についてのシークエンスも同様の方法で、行っている。遺伝子ライブラリーの作成と、そのスクリーニングによるクローニング法に難渋したため、研究の進行は遅れていたが、RT-PCRを利用したクローニング法に変更してからは、比較的順調に進んでおり、今後は、全長のシークエンスを決定し、機能解析へと、進む予定である。補助金により購入した、トランスイルミネーター、エレクトロポレーターは、それぞれDNAの確認、大腸菌への遺伝子導入に汎用しており、本研究の遂行に多大な貢献をしている。
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