歯周病関連細菌の異種菌体間相互作用による病原性の変化に関する研究

• Project/Area Number: 08771713
• Research Category: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Research Field: Conservative dentistry
• Research Institution: Kagoshima University
• Principal Investigator: 中馬 雅彦 鹿児島大学, 歯学部, 助手 (60236825)
• Project Period (FY): 1996
• Project Status: Completed(Fiscal Year 1996)
• Budget Amount: ¥800,000 (Direct Cost : ¥800,000); Fiscal Year 1996 : ¥800,000 (Direct Cost : ¥800,000)
• Keywords: Porphyromonas gingivalis / Actinomyces viscosus / Pathogenicity / Coaggregation

Research Abstract

供試した細菌株は、成人性歯周炎患者の歯周ポケットから分離、同定したP.gingivalis KC-409(以下KC409と略す)及びA.viscosus KWS81(以下KWS81と略す)であった。両菌種はこれまでにin vitroで共疑集することが知られており、口腔内で何らかの相互作用をすることが示唆されているが、この菌株も園典型的な性質を有している。KC409はhemin(5mg/ml)、menadione(2mg/ml)及びyeast extract(5g/L)添加trypticase soy brothに、また、KWS81はGAMブイヨンにそれぞれ接種し、嫌気条件下(N_2:80%,H_2:10%,CO_2:10%)、37℃で前者は2日間、後者は3日間培養し、late exponential phaseにある菌体を用いた。KC409の蛋白分解能の測定は、Arvidsonら(1971)の方法を改変して行い、基質としてcaseinおよびN-α-benzoyl-DL-arginine-p-nitroanillde (BAPNA)を用いた。それによると、caseln分解能に関しては、KC409のみでは24.57U(1U=DA_<280>0.001/min)であったものがKWS81の培養上清と4時間preincubationした時には22.06U、KWS81菌体と4時間preincubationしたKC409のそれは23.28Uとなった。BAPNA分解能に関しては、KC409のみでは34.96U(1U=0.001mmol/min)であったが、KWS81の培養上清とpreincubationした時には31.55U、KWS81菌体とpreincubationした時には32.04Uとなり、いずれの場合もP.gingivalisの蛋白分解活性はA.viscosusまたは、その培養上清とのとの共培養によってわずかながら低下し、その程度はA.viscosus菌体が存在する方が小さいことが示された。
次に、A.viscosusKWS81菌体から、その細胞壁に存在するP.gingivalisとの共疑集因子を、超音波抽出し(以下SEと略す)、SephacrylS-400HRによるゲルろ過、HiTrapQによるイオン交換クロマトグラフィー、HiTrap Octyl Sepharose 4FFによる疎水性クロマトグラフィーで精製を試みた。最初にKC409とSEをpreincubationしたものを10mMPBSpH7.2にて2回洗浄し、50mM glycine buffer pH2.5を添加し、10分間incubationした。その後遠心分離し、上清をSDS-PAGEにかけ、あらかじめP.gingivalisにて吸収操作を行った抗A.viscosusウサギ抗体を用いイムノブロットを行い、活性成分の存在を確認し、精製を進めた。精製された疑集因子はSDS-PAGE上では分子量約20万のスメア-なバンドとして現れ、その性状は耐熱性、pronasePとtrypsinに耐性、過ヨウ素酸に感受性であった。