培養破骨細胞におけるDAMPの局在

• Project/Area Number: 08771747
• Research Category: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Research Field: Conservative dentistry
• Research Institution: Asahi University
• Principal Investigator: 堀木 到 朝日大学, 歯学部, 助手 (00278194)
• Project Period (FY): 1996
• Project Status: Completed (Fiscal Year 1996)
• Budget Amount: ¥900,000 (Direct Cost: ¥900,000); Fiscal Year 1996: ¥900,000 (Direct Cost: ¥900,000)
• Keywords: 破骨細胞 / 細胞内pH

Research Abstract

(方法)生後1日齢の日本白色ウサギを用い、屠殺後四肢の長管骨骨髄を199培地中にて回収した。その後100μl中に100〜200個の破骨細胞懸濁液になるように調整しカバーグラス、骨片上に播種し、15%FCS含有α-MEM培地で48時間培養を行った。培養終了1時間前に破骨細胞内酸性pHの局在を検索する目的でDAMP・HCL(pH測定試薬)を23μl/mlの濃度で培養液に添加した。培養終了後カバーグラス群はホルマリン含有PBSにて固定し一次抗体にDNP抗体、二次抗体に抗ヤギIgGを反応させた。その後細胞内酸性pH局在を可視化するためにPE標識ストレプトアビジンを反応させ蛍光顕微鏡にて観察を行った。また細胞骨格を観察するためにFITC標識ファロイジンもあわせて染色し検討した。骨片上で培養した群は、カバーグラス群と同様の染色を行いレーザー顕微鏡下にて酸性pHの局在を観察した。
(結果)1、カバーグラス群においては核周囲およびポドゾームにDAMPの集積が見られた。
2、骨片上で培養した群では骨表面に接着していると考えられるポドゾーム部に集積が観察された。