植物のジベレリンシグナル伝達における構造生物学的解析
Project/Area Number |
08J06612
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Research Category |
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
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Allocation Type | Single-year Grants |
Section | 国内 |
Research Field |
Structural biochemistry
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Research Institution | Nara Institute of Science and Technology |
Principal Investigator |
村瀬 浩司 奈良先端科学技術大学院大学, 情報科学研究科, 特別研究員(PD)
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Project Period (FY) |
2008 – 2010
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Project Status |
Completed (Fiscal Year 2010)
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Budget Amount *help |
¥2,400,000 (Direct Cost: ¥2,400,000)
Fiscal Year 2010: ¥800,000 (Direct Cost: ¥800,000)
Fiscal Year 2009: ¥800,000 (Direct Cost: ¥800,000)
Fiscal Year 2008: ¥800,000 (Direct Cost: ¥800,000)
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Keywords | 自家不和合性 / アブラナ科 / 構造解析 / ジベレリン / 結晶構造 |
Research Abstract |
本年度は前年度に引き続きアブラナ科植物の自家不和合性に関わる分子の構造解析を目的とする研究を行った。本年度は自家不和合性反応において柱頭で認識反応を行う受容体キナーゼSRKの大量発現系の構築を行った。SRKのキナーゼドメインは大腸菌で発現させると大部分が封入体となって沈殿した。また、可溶性の部分もゲル濾過クロマトグラフィーに供するとほとんどが排除限界に溶出され、正しくフォールディングされていない凝集体となっていることが判明した。この問題を解決するために、フォールディングに悪影響を与えていると予想される24のアミノ酸をピックアップし、ほかのSRKがもっているアミノ酸に置換してフォールディングの改善を試みた。24の置換アミノ酸をもつSRKについて大腸菌で発現させ、そのフォールディングをゲル濾過クロマトグラフィーによって解析したところ、いくつかの置換型SRKのフォールディングに改善がみられた。次に、それらの置換アミノ酸を組み合わせたコンストラクトを作製し、同様に大腸菌で発現させてフォールディングの改善を試みたところ、5つのアミノ酸置換を入れたコンストラクトでかなりの改善が観察された。さらにアミノ酸置換を加えて試験したところ、7つのアミノ酸置換を入れたコンストラクトで、大部分のSRKタンパク質がフォールディングした形で回収することができた。この成果により、SRKのキナーゼドメインはLB培地1Lにつき1-2mg程度発現させることが可能になり、今後の結晶化スクリーニングを行うための基盤を築くことができた。
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Report
(3 results)
Research Products
(14 results)