タンパク質結晶学による二原子酸素添加酵素の分子機構に関する構造化学的研究

• Project/Area Number: 09780605
• Research Category: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Research Field: Biophysics
• Research Institution: Kyoto University
• Principal Investigator: 喜田 昭子 京都大学, 大学院理学研究科, 助手 (70273430)
• Project Period (FY): 1997 – 1998
• Project Status: Completed (Fiscal Year 1998)
• Budget Amount: ¥1,800,000 (Direct Cost: ¥1,800,000); Fiscal Year 1998: ¥700,000 (Direct Cost: ¥700,000); Fiscal Year 1997: ¥1,100,000 (Direct Cost: ¥1,100,000)
• Keywords: 二原子酸素添加酵素 / カテコール2,3-酸化酵素 / メタピロカテカーゼ / X線血漿構造解析 / 結晶化 / メタピロカテカ-ゼ / X線結晶構造解析

Research Abstract

二原子酸素添加酵素は,分子状酸素を基質に取り込ませる反応を触媒する酵素の総称であり,代表的なものとしてカテコール体開裂反応を触媒する酵素がある.われわれはその反応機構を原子レベルで解明することを目指して,Pseudomonas putida由来の二原子酸素添加酵素catechol 2,3-dioxygenase(metapyrocatechase)のX線結晶構造解析を行った.本酵素は純粋なカテコールを基質とする.アミノ酸残基数307個,分子量35kDaのモノマー分子が4量体を形成していて,補欠因子としてモノマーあたり1分子の二価鉄を含んでいる.クエン酸ナトリウムを沈澱剤に用い,マクロシーディング法を段階的に適用することで得た結晶は,空間群P4_22_12,格子定数はa=b=264Å,c=60Åであった.全ての回折強度データはフォトンファクトリーのシンクロトロン放射光を用いて収集した.重原子多重同型置換法を適用し,全アミノ酸残基について分子モデルを構築した.構造の精密化は分子動力学的手法によって行った.現在の分子モデルは水分子114個とアセトン分子を含み,10-2.8Å分解能の反射に対する結晶学的R値は0.20,Free-R値は0.28である.
catechol 2,3-dioxygenase分子は222対称の4量体構造であるが,そのモノマーの構造はビフェニルを基質とする2,3-dihydroxybiphenyl dioxygenaseと類似している.モノマー分子は2つのドメイン(NおよびCドメイン)よりなり,各ドメインのトポロジーにはβαβββモチーフが2回の繰り返されている.非ヘム鉄を含む活性中心はCドメインに存在する.非ヘム鉄を含む活性中心は大きな基質ポケットの奥にあり,鉄原子は2つのヒスチジンと1つのグルタミン酸に配位されている.また,これらの配位子の反対側には,アセトン分子が鉄に覆い被さるように弱く結合していると考えられる電子密度が存在していた.

Research Products

• [Publications] A.Kita,et al.: "An archetypical extradiol-cleaving catecholic dioxygenase: the crystal structure of catechol 2,3-dioxygenase(metapyrocatechase) from pseudomonas putida mt-2." Structure. 7. 25-34 (1999)
• [Publications] A.Kita et al.: "Crystallization and Preliminary X-ray diffraction Studies of Expressed Pseudomonas putida Catechol 2,3-dioxygenase" J.Biochemistry. 122. 201-204 (1997)