B型肝炎ウイルスによる多核化誘発機構の解明

• Project/Area Number: 09J00941
• Research Category: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• Allocation Type: Single-year Grants
• Section: 国内
• Research Field: Virology
• Research Institution: Nagoya City University
• Principal Investigator: 杉山 真也 Nagoya City University, 特別研究員(PD)
• Project Period (FY): 2009 – 2010
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2011)
• Budget Amount: ¥2,800,000 (Direct Cost: ¥2,800,000); Fiscal Year 2011: ¥900,000 (Direct Cost: ¥900,000); Fiscal Year 2010: ¥900,000 (Direct Cost: ¥900,000); Fiscal Year 2009: ¥1,000,000 (Direct Cost: ¥1,000,000)
• Keywords: B型肝炎ウイルス / 遺伝子型 / 正常肝細胞 / 3次元培養 / 多核化 / 病原性 / 発癌 / ゲノム

Research Abstract

本年度は前年度までに樹立を行った3次元での肝細胞培養システムでのアッセイを実施した。複数の細胞株から選定を行い、KIM-1株が最も感染効率が良好であった。HBVの各構成遺伝子を個別に遺伝子導入することでこの多核化出現の原因遺伝子を検討した。各遺伝子の発現の後に、フローサイトメーターで核数の検討を行ったところ、HBX遺伝子を発現するもので多核化が誘導されていた。続いて、HBX遺伝子の野生型、1762T/64A変異型、1653T変異型、1653T & 1762T/64A変異型を作成し、HuH7細胞にトランスフェクションすることでcDNAマイクロアレイ解析を実施した。その結果、1762T/64A変異型では他と比較した場合に、DNA polymerase alpha (POLA)が有意に減少していることを見出した。POLAとChk1のS345リン酸化には密接な関連にあるため、HBXの各変異体に関して、Chk1のS345のリン酸化の程度とPOLAの発現レベルについてリアルタイムPCRとイムノブロットで解析を行なっているところである。並行してHBX遺伝子のトランスジェニックマウス(TGマウス)の作出を実施した。HuH7細胞に使用したものと同じ変異型を利用し、C57BL/6マウスにそれぞれの遺伝子を組み込んだ。PCRとサザンブロットによりトランスジーンの有無を確認し、それぞれのトランスジーンを保有数するHBX-TGマウスを繁殖することができた。現在、各系統でトランスジーンのホモ化作業を進めている。
当初の計画通り、TGマウスの作成と繁殖に成功した。また、in vitroでのマイクロアレイ解析によりChk1と直接的な関連を持つPOLA遺伝子を同定した。細胞株レベルでHBXとChk1、POLAの関係性を解析すると共に、TGマウスを利用して個体レベルで、HBXがもつ肝細胞の多核化機構について検討を進める。

Research Products

• [Journal Article] Host sphingolipid biosynthesis is a promising therapeutic target for the inhibition of hepatitis B virus replication. (2011)
  • Author(s): 立松加奈子
  • Journal Title: Journal of Medical Virology Volume: 83 Pages: 587-593
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Transmissibility of hepatitis B virus (HBV) infection through blood transfusion from blood donors with occult HBV infection (2011)
  • Author(s): Yuen MF
  • Journal Title: Clinical Infectious Diseases Volume: 52 Pages: 624-632
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Virological and clinical characteristics on reactivation of occult hepatitis B in patients with hematological malignancy (2011)
  • Author(s): 菅内文中
  • Journal Title: Journal of Medical Virology Volume: 83 Pages: 412-418
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Direct cytopathic effects of particular hepatitis B virus genotypes in severe combined immunodeficiency transgenic with urokinase-type plasminogen activator mouse with human hepatocytes (2009)
  • Author(s): Sugiyama M
  • Journal Title: Gastroenterology 136 Pages: 652-662
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Genetic variability of hepatitis C virus in South Egypt and its possible clinical implication (2009)
  • Author(s): Elkady A
  • Journal Title: Journal of Medical Virology 81 Pages: 1015-1023
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Genome-wide association of IL28B with response to pegylated interferon-alpha and ribavirin therapy for chronic hepatitis C. (2009)
  • Author(s): Tanaka Y
  • Journal Title: Nature Genetics 41 Pages: 1105-1109
  • Peer Reviewed
• [Presentation] ヒト肝細胞置換キメラマウスでのHBV感染による酸化傷害と線維化 (2010)
  • Author(s): 杉山真也
  • Organizer: 第46回日本肝臓学会総会
  • Place of Presentation: ホテルメトロポリタン山形(山形県)
  • Year and Date: 2010-05-28
• [Presentation] B型肝炎ウイルス遺伝子型D1特異的変異がウイルス複製に与える影響と臨床的意義 (2009)
  • Author(s): 杉山真也
  • Organizer: 日本ウイルス学会
  • Place of Presentation: 都市センターホテル(東京都)
  • Year and Date: 2009-10-27
• [Patent(Industrial Property Rights)] HBV感染症を治療または予防するための医薬組成物 (2009)
  • Inventor(s): 杉山真也
  • Industrial Property Rights Holder: 名古屋市立大学
  • Filing Date: 2009-07-03
  • Overseas