| Project/Area Number |
09J08194
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| Research Category |
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Section | 国内 |
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| Research Field |
Structural biochemistry
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| Research Institution | Tohoku University |
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Principal Investigator |
草間 周介 東北大学, 大学院・理学研究科, 特別研究員(DC2)
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| Project Period (FY) |
2009 – 2010
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| Project Status |
Completed (Fiscal Year 2010)
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| Budget Amount *help |
¥1,400,000 (Direct Cost: ¥1,400,000)
Fiscal Year 2010: ¥700,000 (Direct Cost: ¥700,000)
Fiscal Year 2009: ¥700,000 (Direct Cost: ¥700,000)
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| Keywords | 構成型ヘムオキシゲナーゼ / ヘム分解機構 / 分子内ジスルフィド結合 / 活性化機構 / X線結晶構造解析 / 結核菌由来ヘム分解酵素 / EPR測定 / 共鳴ラマン測定 / カルモジュリン結合型 / 結核菌由来ヘムオキシゲナーゼ / 共鳴ラマンスペクトル |
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| Research Abstract |
本研究の目的はヘムオキシゲナーゼのヘム分解機構と活性化機構解明である。はじめに、構成型ヘムオキシゲナーゼ(HO-2)の研究については活性型と不活性型の結晶構造を明らかにし、その両構造から原子レベル分解能でHO-2の活性化機構を解明する事を目的とした。活性状態である分子内ジスルフィド結合を形成しているSS型HO-2の結晶化、2.0A分解能での回折強度データ収集に成功した。分子置換法による位相決定、モデル構築を行ったが、HO-2独自の活性化機構に関与していると考えられる部位を含む、両末端領域の構造を決定する事ができなかった。そこで、短波長・多波長異常散乱法により位相の改善を行い、新たに構造解析を行った。結果、結晶構造の一部は改善したが、両末端の構造を決定する事はできず、HO-2の末端は非常に運動性が高いことが示唆された。次に結核菌由来ヘム分解酵素MhuDの研究はこれまでに結晶構造のみが解明され、その結晶構造は活性中心に2つのヘム結合する特徴的な構造であった。そこで、本研究はMhuDの特殊なヘム結合様式とその酵素活性への影響、また、反応生成物の解明を目的とした。はじめに、NO結合型ヘム-MhuD複合体のEPR測定と、還元型、CO結合型ヘム-MhuD複合体の共鳴ラマン測定を行い、還元型の軸配位子がHisであることを解明した。MhuDには唯一His75しか存在しないため、還元型においてはHis75が軸配位子であることが明らかとなった。次に、変異体を用いた実験では、軸配位子であるHis75が1つ目のヘム結合に、結晶構造ではヘム遠位側に位置するAsn7が2つ目のヘム結合にも関与している事、さらにAsn7は酵素活性のためにも不可欠であることを解明した。また、ヘムが2つ結合した状態では酵素は不活性であり、この状態はアーティファクトであると考えられる。さらに、NADPH、CPRを電子供給源として用いヘムを分解したのち、デスフェラールとBVRを添加することにより、450nm付近に吸収を持つ反応生成物検出に成功した。
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