| Project/Area Number |
10F00113
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| Research Category |
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Section | 外国 |
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| Research Field |
Applied molecular and cellular biology
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| Research Institution | Niigata University |
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Principal Investigator |
伊藤 紀美子 新潟大学, 自然科学系, 准教授
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
ATTIA K.A. 新潟大学, 自然科学系, 外国人特別研究員
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| Project Period (FY) |
2010 – 2012
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| Project Status |
Completed (Fiscal Year 2012)
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| Budget Amount *help |
¥2,400,000 (Direct Cost: ¥2,400,000)
Fiscal Year 2012: ¥600,000 (Direct Cost: ¥600,000)
Fiscal Year 2011: ¥900,000 (Direct Cost: ¥900,000)
Fiscal Year 2010: ¥900,000 (Direct Cost: ¥900,000)
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| Keywords | SUMO / SUMOylation / rice / thermostress / nuclear domain / Proteomics / SUMOYlation / thermotolerance |
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| Research Abstract |
本年度は質量分析器によるSUMO標的タンパク質の同定効率を高めること、異なるSUMO分子種間の標的タンパク質の同定を目標として研究を行った。
標識タンパクを融合したSUMO分子を構成的に発現させるベクターを導入したイネ培養細胞を作成し、通常条件または高温条件に曝露した後、抗タグ抗体を用いた共免疫沈降法によりSUMOと直接・間接的に相互作用するタンパク質を精製し、質量分析器(LC-MS/MS)により標的タンパク質を同定した。この際、2種の濃度の分離ゲルを用いてサイズ分画し、ゲル内消化後のショットガンMS/MSを行う事により、同定効率を高める事に成功した。また、同様の方法により互いに異なるSUMO分子種、SUMO1、SUMO2、SUMO3について、比較解析を行った。その結果、SUMO1、SUMO2、SUMOO3と直接・間接的に相互作用するタンパク質として同定された約700のタンパク質のうち、いずれのSUMOにも相互作用するタンパク質が約250あった。また、SUMO2に相互作用するタンパク質のうちSUMO2特異的なものは10%のみであり、残りの大半はSUMO1と共通するターゲットであったことから、SUMO1/2は競合的に標的タンパク質に結合し、その際、SUMO1の親和性がより高いと考えられた。
また、高温ストレスへの応答について、タグ抗体を用いた共免疫沈降後のタンパク質の抗SUMO1/2抗体によるウェスタンブロッティングにより解析した。その結果、高温処理によりSUMO1/2に結合・相互作用するタンパク質の増大とともに、フリーのSUMO1/2もその発現が増大する事が明らかになった。一方、SUMO3は構成的に発現していたが、標的タンパク質との結合は高温条件下で特異的に誘導されていた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
標識タンパクを融合したSUMO分子種を導入した培養細胞を作成し、通常条件下または高温環境条件下において生育させ、共免疫沈降法により標的タンパク質を精製し、LC-MS/MSにより標的タンパク質を同定した。この際、サイズ分画およびゲル内消化後のショットガンMS/MSを行う事により、同定効率を著しく高めた。また、異なるSUMO分子種間の標的タンパク質の違いについて、比較解析を行う事が出来た。以上、本年度目標を達成し、成果報告を行った。
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| Strategy for Future Research Activity |
本研究では、細胞レベルにおけるSUMOとSUMO関連タンパク質や標的タンパク質との相互作用と局在性を明らかにし、また、高温ストレスに応答して、SUMOと直接的・間接的に相互作用するタンパク質をLC-MSIMSにより同定した。
当初の発現・精製実験から、His:SUMOの外表面にタグが突出していないと考えられたため、新たに標識タンパク質として蛍光タンパク質タグを用いて免疫沈降および精製を行い、SUMOに直接的・間接的に相互作用するタンパク質を同定した。しかしながら、いくつか予想外の結果も観察された。蛍光タンパク質のタグの大きさからSUMO差含むタンパク質複合体が立体的に若干不安定になっている事が予想され、研究対象となる標的タンパク質によっては、SUMOを標識するタグの種類について更に検討する必要があると考えられた。
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