電位センサータンパク質の作用機序に対する物理化学的手法を用いた解析

• Project/Area Number: 10J01585
• Research Category: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• Allocation Type: Single-year Grants
• Section: 国内
• Research Field: Biophysics
• Research Institution: Osaka University
• Principal Investigator: 川鍋 陽 大阪大学, 医学系研究科, 特別研究員(PD)
• Project Period (FY): 2010 – 2012
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2012)
• Budget Amount: ¥2,800,000 (Direct Cost: ¥2,800,000); Fiscal Year 2012: ¥900,000 (Direct Cost: ¥900,000); Fiscal Year 2011: ¥900,000 (Direct Cost: ¥900,000); Fiscal Year 2010: ¥1,000,000 (Direct Cost: ¥1,000,000)
• Keywords: 電位センサータンパク質 / 電位依存性プロトンチャネル / VSOP / パッチクランプ / リポソーム / インサイドアウト / 赤外分光 / パッチクランプ法 / 生物物理 / 赤外分光法 / バッチクランプ法

Research Abstract

本研究では、電位センサータンパク質であるVSOP(電位依存性プロトンチャネル)の電位感知メカニズムをはじめとする基本的な性質を、電気生理学的な手法(主にパッチクランプ法)と物理化学的手法(主に赤外分光法)を組み合わせて明らかにすることが目標である。本年度の研究成果の概要を以下に記述する。前年度までに活性のあるマウス由来VSOPを発現する系を確立した。本年度は計測のさらなる改善と薬理効果を検討するための培養細胞系を用いた評価を行っている。
1.全反射赤外分光法にて基質結合やpH変化に伴う構造変化の解析を行ったが、精度のよいスペクトルを得ることができなかった。前年度に引き続き、タンパク質と脂質の比率を見直すなど条件検討をし直している。
2.プロテオリポソームに対してパッチクランプ法を適用する電気生理学的な解析を前年度に引き続き試みている。VSOPはそのコンダクタンスが数百fS程度と極めて小さいと示唆されており、これは、一般的なK^+,Na^+などを通すイオンチャネルの1/1000のレベルである。そこで、可能な限りノイズが入らない環境で新たに測定装置を組み上げ、現在予備実験の段階であるが、VSOP由来とみられる電流を計測することに成功した。今後さらに解析していくために、亜鉛イオンや下記の不飽和脂肪酸への応答性などの薬理効果を見ていく予定である。
3.電位依存性プロトンチャネルはその分子実体が判明する前から不飽和脂肪酸(主にアラキドン酸)により電流が増大することが知られていた。しかし、それらはネイティブの細胞の結果であり、メカニズムの詳細などに迫る強制発現系での実験はこれまでになかった。培養細胞を用いたインサイドアウトパッチクランプ法で測定したところ、不飽和脂肪酸の効果で電流が増大することがわかった。これは不飽和脂肪酸が直接作用することを示唆しており今後、部位の特定やメカニズムに迫っていきたい。

Research Products

• [Journal Article] Comparative FTIR study of a new fungal rhodopsin (2012)
  • Author(s): Ito, H., Sumii, M., Kawanabe, A., Fan, Y., Furutani, Y., Brown, L. S., Kandori, H.
  • Journal Title: J. Phys. Chem. B Volume: 116 Issue: 39 Pages: 11881-11889
  • DOI: 10.1021/jp306993a
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Anomalous pH Effect of Blue Proteorhodopsin (2012)
  • Author(s): Yamada, K., Kawanabe, A., Yoshizawa, S., Inoue, K., Kogure, K., Kandori, H.
  • Journal Title: J. Phys. Chem. Let. Volume: 3 Pages: 800-804
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Diversity and functional analysis of proteorhodopsin in marine Flavobacteria (2012)
  • Author(s): Yoshizawa, S., Kawanabe, A., Ito, H., Kandori, H., Kogure, K.
  • Journal Title: Environ. Microbiol. Volume: 14 Issue: 5 Pages: 1280-1284
  • DOI: 10.1111/j.1462-2920.2012.02702.x
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Anomalous pH Effect of Blue Proteorhodopsin (2012)
  • Author(s): Yamada, K., Kawanabe, A., Yoshizawa, S., Inoue, K., Kogure, K., Kandori, H.
  • Journal Title: J.Phys.Chem.Let. Volume: (印刷中)(in press)
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Diversity and functional analysis of proteorhodopsin in marine Flavobacteria (2012)
  • Author(s): Yoshizawa, S., Kawanabe, A., Ito, H., Kandori, H., Kogure, K.
  • Journal Title: Environ.Microbiol. Volume: (印刷中)(in press)
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Structural characteristics around the β-ionone ring of the retinal chromophore in Salinibacter sensory rhodopsin I (2011)
  • Author(s): Irieda, H., Reissig, L., Kawanabe, A., Homma, M., Kandori, H., Sudo, Y.
  • Journal Title: Biochemistry Volume: 50 Pages: 4912-4922
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Chimeric Microbial Rhodopsins Containing the Third Cytoplasmic Loop of Bovine Rhodopsin (2011)
  • Author(s): Nakatsuma, A., Yamashita, T., Sasaki, K., Kawanabe, A., Inoue, K., Furutani, Y., Shichida, Y., Kandori, H.
  • Journal Title: Biophys.J. Volume: 100 Pages: 1874-1882
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] An inward proton transport using anabaena sensory rhodospin (2011)
  • Author(s): Kawanabe, A., Furutani, Y., Jung, K.H., Kandori, H.
  • Journal Title: J.Microbiol. Volume: 49 Pages: 1-6
• [Journal Article] 逆向きプロトン輸送タンパク質の創成 (2010)
  • Author(s): 川鍋陽、古谷祐詞、神取秀樹
  • Journal Title: 生物物理 Volume: 50 Pages: 236-237
  • NAID: 10026670680
  • Peer Reviewed
• [Presentation] 人工膜を用いた電位依存性プロトンチャネルの膜電流計測の最適化 (2013)
  • Author(s): 川鍋陽、岡村康司
  • Organizer: 第90回日本生理学会大会
  • Place of Presentation: タワーホール船越(東京)
• [Presentation] 人工膜に再構成した電位依存性プロトンチャネルVSOPのチャネル活性 (2012)
  • Author(s): 川鍋陽、岡村康司
  • Organizer: 第89回日本生理学会大会
  • Place of Presentation: 長野県松本文化会館(長野)
  • Year and Date: 2012-03-29
• [Presentation] The function of a microbial rhodopsin (2012)
  • Author(s): Akira Kawanabe, Hideki Kandori
  • Organizer: 4th International Conffernece for Biosciences and Biotechnology
  • Place of Presentation: Udayana大学 (インドネシア・バリ)(招待講演)
• [Presentation] 膜電位を感じるタンパク質の研究 (2011)
  • Author(s): 川鍋陽
  • Organizer: 生物物理化学研究会シンポジウム「光といのち」
  • Place of Presentation: 名古屋工業大学(愛知)(招待講演)
  • Year and Date: 2011-12-25
• [Presentation] 電位依存性プロトンチャネルVSOPのチャネル活性の定量解析 (2011)
  • Author(s): 川鍋陽、岡村康司
  • Organizer: 第104回近畿生理学談話会
  • Place of Presentation: 大阪医科大学(大阪)
  • Year and Date: 2011-10-01
• [Presentation] 電位依存性プロトンチャネルVSOPの物理化学的手法を用いた解析 (2011)
  • Author(s): 川鍋陽、岡村康司
  • Organizer: 日本生物物理学会第49回年会
  • Place of Presentation: 兵庫県立大学(兵庫)
  • Year and Date: 2011-09-18
• [Presentation] 電位依存性プロトンチャネルVSOPの赤外分光計測に向けて (2011)
  • Author(s): 川鍋陽
  • Organizer: 第88回日本生理学会大会
  • Place of Presentation: パシフィコ横浜(神奈川県)
• [Presentation] プロテオロドプシンが生理的な条件でプロトンポンプとしてはたらくことの直接的な証明 (2010)
  • Author(s): 川鍋陽
  • Organizer: 日本生物物理学会第48回年会
  • Place of Presentation: 東北大学(宮城県)
• [Remarks]
  • URL: http://www.med.osaka-u.ac.jp/pub/phys2/okamura/index.html
• [Remarks]
  • URL: http://www.med.osaka-u.ac.jp/pub/phys2/okamura/index.html
• [Remarks]
  • URL: http://www.med.osaka-u.ac.jp/pub/phys2/okamura/index.html