| Project/Area Number |
10J04346
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| Research Category |
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Section | 国内 |
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| Research Field |
Chemistry related to living body
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
内之宮 祥平 京都大学, 工学研究科, 特別研究員(DC1)
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| Project Period (FY) |
2010 – 2012
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| Project Status |
Completed (Fiscal Year 2012)
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| Budget Amount *help |
¥2,100,000 (Direct Cost: ¥2,100,000)
Fiscal Year 2012: ¥700,000 (Direct Cost: ¥700,000)
Fiscal Year 2011: ¥700,000 (Direct Cost: ¥700,000)
Fiscal Year 2010: ¥700,000 (Direct Cost: ¥700,000)
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| Keywords | タンパク質ラベル / 細胞内ラベル / 蛍光イメージング / タンパク質間相互作用の解析 / Hisタグ / Ni-NTA / ファルネシル化EGFP / ラベル化タンパク質の拡張 / ラベル化プローブの拡張 / プロテアソーム分解 / タンパク質半減期測定 / 細胞膜透過性 / キャリアーペプチド / Oligo Arg配列 / Oligo His配列 |
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| Research Abstract |
タンパク質に人工の機能性分子を特異的にラベル化する手法の開発は、タンパク質の機能解析に重要であるが、細胞内で目的タンパク質のラベル化と機能解析を行っている例は極めて少ない。申請者は、細胞内で標的タンパク質のラベル化と機能解析を目的としている。本研究では、オリゴヒスチジン(Hisタグ)と、ニトリロ三酢酸のNi錯体(Ni-NTA)間相互作用を利用した共有結合ラベル化法の開発を行っており、前年度までに細胞内での選択的ラベル化に成功した。本年度は、ラベル化タンパク質の機能解析を行った。
まず、細胞内での蛍光イメージングを行った。標的としては細胞膜の内側に発現させたファルネシル化mcherry(mcherry-f)を選択し、タグ導入mcherry-fをA549細胞に強制発現させた。この細胞に、蛍光色素であるフルオレセインを有するNi-NTAを導入したところ、細胞膜の内側からフルオレセインの蛍光が見られr、mcherry-fの蛍光局在と良く一致した。また、タグの無いmcherrry-fの場合は同様の蛍光は見られなかったことから、細胞内でタグ導入タンパク質のイメージングに成功した。
次に、タンパク質間相互作用を光クロスリンクによって検出した。光クロスリンクでは、光反応基をタンパク質に導入し、UVを照射することで相互作用している2つのタンパク質を共有結合で架橋する(光架橋)。この光架橋での分子量変化をウエスタンブロッティングによって解析した。ラバマイシン存在下でFKBP12と相互作用するFRBにタグを導入し、光反応基としてジアジリンをラベル化した。次に、ラバマイシンを添加した後、UV照射した。結果、UV照射、ラバマイシン存在下でのみ、FKBP12とFRBの複合体と思われる分子量にバンドが確認された。
以上より、本研究によって細胞内で特定タンパク質選択的ラベル化と機能解析に成功した。
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