カルモデュリン依存性蛋白質燐酸化反応による脳由来神経栄養因子産生の調節機構

• Project/Area Number: 11157226
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Research Institution: Kumamoto University
• Principal Investigator: 山本 秀幸 熊本大学, 医学部, 講師 (60191433)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 笠原 二郎 熊本大学, 医学部, 助手 (10295131) ; 福永 浩司 熊本大学, 医学部, 助教授 (90136721) ; 宮本 英七 熊本大学, 医学部, 教授 (50109659)
• Project Period (FY): 1999
• Project Status: Completed (Fiscal Year 1999)
• Budget Amount: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,300,000); Fiscal Year 1999: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,300,000)
• Keywords: NG108-15細胞 / カルシウム / カルモデュリン / カルモデュリンキナーゼII / 神経細胞死 / 転写調節 / 脳由来神経栄養因子(BDNF) / プロモーター解析

Research Abstract

脳由来神経栄養因子(BDNF)は脳内に多量に発現しており、神経細胞に対し、強い生存維持活性をもつことが知られている。これまでに電位依存性Ca^<2+>チャネルの開口に伴う神経細胞内へのCa^<2+>の流入がBDNFのmRNAの発現を増加することが報告されていた。今回、本反応にCa^<2+>/カルモデュリン依存性蛋白質燐酸化酵素II(CaMキナーゼII)が関与する可能性について検討した。すなわち、モデル系として、CaMキナーゼIIの中で神経細胞の核内に存在するアイソフォームであるアルファBやデルタ3をNG108-15細胞に過剰発現させた。1.NG108-15細胞では、BDNFのmRNAの中でエキソンIVを含むBDNF(IV-BDNF)のmRNAが多量に発現していた。2.定量RT-PCR法による検討では電位依存性Ca^<2+>1チャネルを開口させるBay-K8644の処理により、IV-BDNFのmRNAが増加した。3.アルファBやデルタ3の過剰発現によりIV-BDNFのmRNAの増加が有意に増強された。核内に移行しないデルタ1の過剰発現では増強効果は認められなかった。4.酵素のATP結合部位のアミノ酸を置換させ、活性をもたない変異体を作製した。得られた変異体の過剰発現ではIV-BDNFのmRNAの発現増強は認められなかった。5.ルシフェラーゼ遺伝子をレポーター遺伝子とし、IV-BDNFのプロモーター活性を検討した。ルシフェラーゼ活性はアルファBやデルタ3の過剰発現により増強された。6.免疫染色法によりBDNF蛋白質の発現について検討した。核内にアルファBやデルタ3を過剰発現する細胞のみがBDNFに対する抗体で強く染色された。
今回の結果から、神経細胞内へのCa^<2+>の流入によるBDNFの発現に核内に存在するCaMキナーゼIIが関与することが明らかになった。今後、神経細胞死の防御への応用を検討する予定である。

Research Products

• [Publications] Takeuchi. Y.: "Nuclear localization of the δ subunit of Ca^<2+>/calmodulin-dependent protein kinase II in rat cerebellar granule cells."J. Neurochem.. 72. 815-825 (1999)
• [Publications] Ohmitsu, M.: "Phosphorylation of myristoylated alanin-rich protein kinase C substrate by mitogen-activated protein kinase in cultured rat hippocampal neurons following stimulation of glutamate receptors."J. Biol. Chem.. 274. 408-417 (1999)
• [Publications] Matsumoto, K.: "Cloning from insulinoma cells of synapsin I associated with insulin secretory granules."J. Biol. Chem.. 274. 2053-2059 (1999)
• [Publications] Nakai, M.: "Amyloid β protein (25-35) phosphorylates MARCKS through tyrosine kinase-activated protein kinase C signaling pathway in microglia."J. Neurochem.. 72. 1179-1186 (1999)
• [Publications] Masuko, N.: "Interaction of NE-dlg/SAP102, a neuronal and endocrine tissue-specific membrane-associated guanylate kinase protein, with calmodulin and PSD-95/SAP90. A possible regulatory role in molecular clustering at synaptic sites."J. Biol. Chem.. 274. 5782-5790 (1999)
• [Publications] Nishiyama, Y.: "A human homolog of Drosophila warts tumor suppressor, h-warts, localized to mitotic apparatus and specifically phosphrylated during mitosis."FEBS Lett.. 459. 159-165 (1999)
• [Publications] Liu, J: "Differential roles of Ca^<2+>/calmodulin-dependent protein kinase II and mitogen-activated protein kinase activation in hippocampal long-term potentiation."J. Neurosci.. 19. 8292-8299 (1999)
• [Publications] Ogata, N.: "Involvement of protein kinase C in superoxide anion-induced activation of nuclear factor-κB in human endothelial cells."Cardiovasc. Res.. 45. 513-521 (2000)
• [Publications] Takeuchi, Y.: "Increase of brain-derived neurotropic factor gene expression in NG108-15 cells by the nuclear isoforms of Ca^<2+>/calmodulin-dependent protein kinase II."J. Neurochem.. (in press). (2000)
• [Publications] Takeuchi, Y.: "Identification of the isoforms of Ca^<2+>/calmodulin-dependent protein kinase II in rat astrocytes and their subcellular localization."J. Neurochem.. (in press). (2000)