| Budget Amount *help |
¥3,500,000 (Direct Cost: ¥3,500,000)
Fiscal Year 2000: ¥1,100,000 (Direct Cost: ¥1,100,000)
Fiscal Year 1999: ¥2,400,000 (Direct Cost: ¥2,400,000)
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| Research Abstract |
軟骨の細胞外マトリックスで分化マーカーでもあるII型コラーゲン遺伝子の組織特異的な発現を制御しているエンハンサーに結合する因子を軟骨細胞cDNA発現ライブラリーを用いてサウスウエスタンスクリーニングを行い,DNA結合蛋白質のcDNAを4クローン得た.
1)トランスジェニックを用いた解析
このうちの一つのクローン(コンドロカルシン)の過剰発現トランスジェニックマウスを作製し,体格の小さい,軟骨の最終分化である,石灰化の異常を示すマウスを得て、解析した.このマウスは,胎生期の軟骨組織において,正常のコンドロカルシンの約4倍のコンドロカルシンを発現していた.成長軟骨の肥大軟骨細胞層の細胞外マトリックスに導入遺伝子産物を認め,さらに,免疫電顕にて肥大軟骨細胞の細胞内(r ERと核内)にも導入遺伝子産物を認めた.このことより,コンドロカルシンは,細胞外マトリックスにて,石灰化に関与しているとともに,軟骨細胞内に取り込まれて核内に運ばれ,そこで何らかの機能を持っている可能性が考えられた.
2)ノックアウトマウスを用いた解析
これらのクローンのマウス遺伝子をジェノミックライブラリースクリーニングにより得て,遺伝子構造を明らかにした.また,マウスES細胞での発現を解析した.これらのクローンのうち2クローンはマウスES細胞で遺伝子発現していることがわかり,そのうちの一つについてプロモーターレスノックアウトコンストラクトを作成し,電気穿孔法によりES細胞に導入し,遺伝子導入されたクローンを得た.今後,これらのクローンのキメラマウスを作成し,ノックアウトマウスを得ることができる.
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