エクソンスキッピング誘導による筋ジストロフィー遺伝子治療に関する研究

• Project/Area Number: 11770406
• Research Category: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Research Field: Pediatrics
• Research Institution: Kobe University
• Principal Investigator: 竹島 泰弘 神戸大学, 医学部・附属病院, 助手 (40281141)
• Project Period (FY): 1999 – 2000
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2000)
• Budget Amount: ¥2,200,000 (Direct Cost: ¥2,200,000); Fiscal Year 2000: ¥1,100,000 (Direct Cost: ¥1,100,000); Fiscal Year 1999: ¥1,100,000 (Direct Cost: ¥1,100,000)
• Keywords: 筋ジストロフィー / 遺伝子治療 / スプライシング / アンチセンスオリゴヌクレオチド

Research Abstract

ジストロフィン遺伝子の欠失により、mRNA上で欠失している領域の塩基数が3の倍数+1あるいは+2(out-of-frame)であるとDuchenne型筋ジストロフィー症(DMD)となるが、3の倍数(in-frame)であるとより軽症なBecker型筋ジストロフィー症(BMD)となる。申請者は先にジストロフィン遺伝子エクソン19内にスプライシング部位決定に重要な塩基配列であるスプライシング促進配列(SES)が存在し、さらにSESに対するアンチセンスオリゴヌクレオチド(AS-oligo)によりスプライシングの過程においてエクソン19のスキッピングを誘導し得ることをin vitro、培養細胞およびマウスへの全身投与において明らかにした。このことを臨床に応用すると、DMDの症例の欠失領域に隣接するエクソンをAS-oligoによりmRNA上から消失させ、欠失領域の長さををout-of-frameからin-frameに変換し、表現型を軽症化することが可能である。現在、エクソン20に欠失を有するDMD症例に対してAS-oligoを投与し、エクソン19のスキッピングを誘導することによる治療の臨床応用の準備段階に入っている。今回、このような治療の適応を拡げるために、ジストロフィン遺伝子の欠失好発部位(エクソン44-52)周辺のエクソンにおけるSESを検討した。
in vitroスプライシング系において、ショウジョウバエのdsx遺伝子エクソン3・イントロン3・エクソン4より成るmRNA前駆体は、エクソン4にSES活性を有する塩基配列が付加されることによりイントロン3のスプライシングが誘導される。このことを利用しジストロフィン遺伝子エクソン43、46、53内のSES候補配列の活性を検討した。その結果エクソン43、53においてSES活性を有する塩基配列が同定された。これらのSESに対するAS-oligoによりエクソンスキッピング誘導することが可能であると、スプライシングを制御することによるDMDに対する治療の適応を拡大することが可能である。

Research Products

• [Publications] Suminaga R.: "Non homologous recombination between Alu and LINE-1 repeats caused a 430-kb deletion in the dystrophin gene : a novel source of genomic instability."J.Hum.Genet. 45. 331-336 (2000)
• [Publications] Pramono Z.A.D.: "A novel cryptic exon in intron 2 of the human dystrophin gene evolved from an intron by acquiring consensus sequences for splicing at different stages of anthropoid evolution."Biochem.Biophys.Res.Commun.. 267. 321-328 (2000)
• [Publications] Suminaga R.: "Analysis of a nonsense mutation of the alpha-actinin-3 gene in Japanese patients with dystrophinopathy."Am.J.Med.Genet.. 92. 77-78 (2000)
• [Publications] Wibawa T.: "Complete skipping of exon 66 due to novel mutations of the dystrophin gene was identified in two Japanese families of Duchenne muscular dystrophy with severe mental retardation."Brain Dev.. 22. 107-112 (2000)
• [Publications] A.Surono,Y.Takeshima et.al.: "Circular dystrophin RNAs consisting of exons that were skipped by alternative splicing"Hum.Mol.Genet.. 8. 493-500 (1999)
• [Publications] D-H.Chen,Y.Takeshima et.al.: "A novel deletion of the dystrophin S-promotor region cosegregating with mental retardation"Neurology. 52. 638-640 (1999)