ゲノム防御機構とがん抑制蛋白p53

• Project/Area Number: 12143205
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• Allocation Type: Single-year Grants
• Review Section: Biological Sciences
• Research Institution: Kumamoto University
• Principal Investigator: 山泉 克 熊本大学, 発生医学研究センター, 教授 (70107093)
• Project Period (FY): 2000 – 2004
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2004)
• Budget Amount: ¥37,200,000 (Direct Cost: ¥37,200,000); Fiscal Year 2004: ¥10,900,000 (Direct Cost: ¥10,900,000); Fiscal Year 2003: ¥10,900,000 (Direct Cost: ¥10,900,000); Fiscal Year 2002: ¥7,700,000 (Direct Cost: ¥7,700,000); Fiscal Year 2001: ¥7,700,000 (Direct Cost: ¥7,700,000)
• Keywords: 複製後修復 / Rad18 / Rad6 / ユビキチン化 / 細胞内局在 / TLS / polη / PCNA / ゲノム不安定性 / 発現調節 / UV^SS / TCR / ゲノム不安定化 / p53 / MAPキナーゼ / p38 / ES細胞 / ノックアウトマウス

Research Abstract

紫外線により誘導されるピリミジン2量体は他の損傷と比較して修復効率が悪く、DNA複製の進行を阻害することが多い。Rad18はRad6と共同して停止部位でのPCNAをモノユビキチン化することで、損傷乗り越え合成に関与するポリメラーゼηの誘導に関与することを示した。Rad18蛋白質はSDS-PAGEにおいて2本のバンドとして検出される。このうち85kdに相当する分子種は75kdに相当するもう1本の分子種がモノユビキチン化したものであることを質量分析により明らかにした。Rad18のモノユビキチン化機構を解明するため、分子内のRINGフィンガー領域(RFD)及びZnフィンガー領域(ZFD)に点突然変異を導入し、これらの変異Rad18蛋白質のモノユビキチン化を野生型と比較検討した。野生型Rad18蛋白はRad6蛋白の発現量に依存してモノユビキチン化が促進されるのに対してZFD変異型ではモノユビキ・チン化がほとんど見られなくなること、RFD変異型は速やかに分解され、発現量が著しく減少することがわかった。また、Rad6結合部位(R6BD)を欠損したRad18は野生型細胞中ではモノユビキチン化されるのに対し、Rad18^<-/->マウス細胞中ではモノユビキチン化されない。一方、ZFD変異型Rad18は両細胞中でもモノユビキチン化されないことが明らかとなった。更に酵母でのTwo-hybrid法の解析からRad18蛋白はZFDで2量体を形成することも明らかとなった。これらの実験結果より以下のモデルを提唱した。Rad18はR6BDを介してRad6と結合する一方、ZFDを介して2量体を形成する。2量体中の一方のRad18はRad6と結合したもう一方のRad18によりモノユビキチン化される。更にこれら2種類のRad18蛋白質の細胞内局在を免疫染色法や生化学的方法を用いて解析した結果、モノユビキチン化されたRad18は主として細胞質に局在し、ユビキチン化をうけていない未修飾型Rad18は核内に局在することが明らかとなった。これらの実験結果は、過剰なRad18をモノユビキチン化することで核から排除し、核内のRad18の量を調節している可能性を示す。

Research Products

• [Journal Article] Differential regulation of Radl8 through Rad6-dependent mono- and polyubiquitination (2005)
  • Author(s): Miyase, S., et al.
  • Journal Title: Journal of Biological Chemistry 280 Pages: 515-524
• [Journal Article] Rad 18 guides poη to replication stalling sites through physical interaction and PCNA monoubiquitination (2004)
  • Author(s): Watanabe, K., et al.
  • Journal Title: The EMBO Journal 23 Pages: 3886-3896
• [Publications] Sonoda, E., et al.: "Multiple roles of Rev3, the catalytic subunit of polz in maintaining genome stability in vertebrate"The EMBO Journal. 22(12). 3188-3197 (2003)
• [Publications] Takagi, Y., et al.: "Roles of MGMT and MLH1 proteins in alkylation-induced apoptosis and mutagenesis"DNA Repair. 2. 1135-1146 (2003)
• [Publications] Ren., Y., et al.: "Three novel mutations responsible for Cockayne syndrome group A"Genes & Genetic Systems. 78. 93-102 (2003)
• [Publications] Tateishi, S., et al.: "Enhanced genomic instability and defective postreplication repair in RAD18 knockout mouse embryonic stem cells"Molecular and Cellular Biology. 23(2). 474-481 (2003)
• [Publications] Okada, T., et al.: "Involvement of verebrate Pol in Rad 18-dependent postreplication repair of UV damage"Journal of Biological Chemistry. 277(50). 48690-48695 (2002)
• [Publications] Yamashita, Y.M., et al.: "RAD18 and RAD54 cooperatively contribute to maintenance of genomic stability in vertebrate cells"The EMBO Journal. 21(20). 5558-5566 (2002)
• [Publications] Ren., Y., et al.: "Three novel mutations responsible for Cockayne syndrome group A"Genes & Genetic Systems. (in press).
• [Publications] Tateishi, S., et al.: "Enhanced genomic instability and defective postreplication repair in RAD18 Knockout mouse embryonic stem cells"Molecular and Cellular Biology. 23(2). 474-481 (2003)
• [Publications] Okada, T., et al.: "Involvement of verebrate Polk in Rad18-independent postreplication repair of UV damage"Journal of Biological Chemistry. 277(50). 48690-48695 (2002)
• [Publications] Yamashita, Y.M., et al.: "RAD18 and RAD54 cooperatively contribute to maintenance of genomic stability in vertebrate cells"EMBO Journal. 21(20). 5558-5566 (2002)
• [Publications] 立石 智, 山泉 克: "損傷トレランスとRAD6エピスタシス遺伝子群(Tolerance of DNA damage and RAD6 epistasis group)"蛋白質核酸酵素. 46(8). 1116-1123 (2001)
• [Publications] Kishi, H.: "Osmotic shock induces G_1 arrest through p53 phosphorylation at Ser^<33> by activated p38^<MAPK> without phosphorylation at Ser^<15> and Ser^<20>"Journal of Biological Chemistry. 276(42). 39115-39122 (2001)
• [Publications] Nitta, M.: "Characterization and tumorigenicity of human ovarian surface epithelial cells immortalized by SV4O large T antigen"Gynecologic Oncology. 81(1). 10-17 (2001)
• [Publications] Nichols,A.F.: "Human damage-specific DNA-binding protein p48.Characterization of XPE mutations and regulation following UV irradiation"J.Biol.Chem.. 275(28). 21422-21428 (2000)
• [Publications] Tateishi,S.: "Dysfunction of human Rad18 results in defective postreplication repair and hypersensitivity to multiple mutagens"Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 97. 7927-7932 (2000)
• [Publications] Itoh,T.: "Reinvestigation of the classification of five cell strains of xeroderma pigmentosum group E with reclassification of three of them"J.Invest.Dermatol.. 114(5). 1022-1029 (2000)
• [Publications] Itoh,T.: "UV^s syndrome : Establishment and characterization of fibroblastic cell lines transformed with siminan virus 40"J.Invest.Dermatol.. 114(1). 101-106 (2000)