| Budget Amount *help |
¥2,200,000 (Direct Cost: ¥2,200,000)
Fiscal Year 2001: ¥1,100,000 (Direct Cost: ¥1,100,000)
Fiscal Year 2000: ¥1,100,000 (Direct Cost: ¥1,100,000)
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| Research Abstract |
輸送レセプターPV72はタイプ1の膜タンパク質で,ルーメンドメインで液胞タンパク質と結合しその細胞内輸送を行っている.PV72のC末端37アミノ酸は細胞質側に出ており,他の因子と相互作用することにより,PV72の細胞内局在性や機能を制御していると考えられる.本研究では,PV72の細胞質ドメインに注目し,輸送を担う輸送装置の面から,液胞タンパク質の細胞内輸送の分子機構を解析した.
輸送レセプターPV72のルーメンドメインをGFPに置換したコンストラクトをシロイヌナズナ培養細胞に一過的に発現させた.その結果,細胞質中にドット状の蛍光パターンが見られた.培養細胞の内在性のレセプターを蛍光抗体法で検出すると,GFP蛍光と一致したことから,本コンストラクトは正しい細胞内局在性を反映していると考えられた.一過的発現でドット状の蛍光パターンになった後に,細胞を薬剤ブレフェルジンAで処理すると,GFP蛍光はネットワーク状になった.さらに,GFP蛍光はRGP1タンパク質の蛍光抗体法によるパターンと一致した.これらの結果から,本レセプターはゴルジ体に局在していることが判明した.
PV72の細胞質ドメインと相互作用する因子を探索するために,上記GFPコンストラクトのデリーションシリーズを作製し解析した.その結果,細胞質ドメインを削るとゴルジ体には留まれず,GFPが細胞膜まで運ばれることが判明した.C末端35アミノ酸まで削っても同様の結果であった.このことから,細胞質ドメインのN末付近の配列が何らかの因子と相互作用しゴルジ体局在化に必要でると考えられた.細胞質ドメインのチロシンモチーフのチロシンをアラニンに置換すると,液胞に到達しやすくなることが判明した.このことから,チロシンモチーフが細胞質因子と相互作用し,PV72のゴルジ体へのリサイクルに効いている可能性が考えられた.
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