RDA法とマイクロアレイを用いたEW-WT1キメラcDNAの標的遺伝子の単離

Research Project

Project/Area Number	12770379
Research Category	Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
Allocation Type	Single-year Grants
Research Field	Pediatrics
Research Institution	The University of Tokyo
Principal Investigator	井田孔明東京大学, 医学部・附属病院, 助手 (60313128)
Project Period (FY)	2000 – 2001
Project Status	Completed (Fiscal Year 2001)
Budget Amount *help	¥2,200,000 (Direct Cost: ¥2,200,000) Fiscal Year 2001: ¥1,100,000 (Direct Cost: ¥1,100,000) Fiscal Year 2000: ¥1,100,000 (Direct Cost: ¥1,100,000)
Keywords	EWS遺伝子 / WT1遺伝子 / RDA法 / 小児腫瘍 / p300遺伝子 / desmoplastic small round cell sarcoma / ユーイング肉腫 / ウィルムス腫瘍
Research Abstract	t(11 ; 22)とEWS-WT1融合遺伝手を有するdesmoplastic small round cell sarcoma(DSRCS)の患者の3検体よりtotal RNAを抽出し、reverse transcriptase(RT)- polymerase chain reaction(PCR)法でEWS-WT1遺伝子の切断点を含むcDNAの小断片を得、これを用いてcDNAライブラリーより全領域を含んだEWS-WT1 cDNAをスクリーニングして合成した。このcDNAを発現ベクターに挿入して、EWS-WT1発現プラスミドを作成した。このEWS/WT1発現プラスミドをいれたベクターと発現ベクターのみをそれぞれNIH3T3細胞株に遺伝子導入して、安定した細胞のコロニーを選択した。ベクターのみを遺伝子導入させたNIH3T3細胞株およびEWS-WT1を遺伝子導入させたNIH3T3細胞株からtotal RNAを抽出し、これらのcDNAを合成し、representational difference analysis(RDA)法を行った。Two cells hybridization法でハイブリダンジエイションをくり返し、異なったバンドを切り出し、得られた遺伝子の塩基配列を決定し、Genebankにて検索した。5個のcDNA断片がとれ、これらは1つは既知のp300遺伝子であり、残り4つは未知のESTであることが判明した。p300は転写コアクチベーターで、基本転写因子結合しアセチル化に関連することがわかっている。このp300の発現プラスミドを作成し、これらと作成したEWS-WT1発現プラミドとをNIH3T3細胞株にco-transfectionして、転写活性assayを用いて、EWS-WT1遺伝子の転写活性を調べた。導入細胞はin vitroの培養で非導入細胞に比べて、著明な増殖がみられた。詳細な機能解析を行っている。さらに種々の小児固形腫瘍と白血病の細胞株と、正常末梢血よりDNAを抽出し、両者のゲノムの増幅や欠失をRDA法を用いて検索したが、増幅や欠失はみられなかった。現在未知の4つのESTの解析を行っている。