骨芽細胞におけるPTH/PTHrP受容体遺伝子発現調節に関する研究

Research Project

Project/Area Number	12771130
Research Category	Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
Allocation Type	Single-year Grants
Research Field	病態科学系歯学(含放射線系歯学)
Research Institution	Ohu University
Principal Investigator	川根徹也奥羽大学, 歯学部, 助手 (00265208)
Project Period (FY)	2000 – 2001
Project Status	Completed (Fiscal Year 2001)
Budget Amount *help	¥2,000,000 (Direct Cost: ¥2,000,000) Fiscal Year 2001: ¥600,000 (Direct Cost: ¥600,000) Fiscal Year 2000: ¥1,400,000 (Direct Cost: ¥1,400,000)
Keywords	PTH / PTHrP receptor / osteoblast / p42 / 44MAP kinase / MAP kinase
Research Abstract	副甲状腺ホルモン(PTH)は骨芽細胞に作用して、コラーゲン分解酵素や破骨細胞活性化因子であるRANKLの発現を誘導することで、骨吸収を促進させるカルシウム代謝調節ホルモンである。本研究では、このPTHの受容体であるPTH/PTHrP受容体(PTHR)の遺伝子発現に影響を与えるシグナル導入経路を、ラット骨芽細胞様細胞株であるUMR106を用いて解析するとともに、このシグナルの影響がおよぶPTHR遺伝子プロモーター領域上の作用部位についても検討したところ、以下のような結果が得られた。(1)フォルスコリンもしくは(Bu)_2cAMPによるPTHR mRNAレベルの低下作用は、PKA阻害剤であるH89およびタンパク質合成阻害剤であるシクロヘキシミドによっては阻止されなかった。これよりcAMPレベルが上昇するとPTHR mRNAレベルは低下するが、この現象にはPKA経路を介さない別の経路が働くことおよび既存のタンパク質の修飾によることが予想された。(2)正常ラットのゲノムライブラリーを作製し、これよりプロモーター領域を含むクローンを得ることで、ラットPTHR遺伝子のエクソンU1から上流約6.9kb(エクソンU2、U3を含むBamHI-BamHIフラグメント)のプロモーター領域およびエクソンU1-S間のイントロン(BmmHI-NaeIフラグメント)の塩基配列を決定した。(3)(2)で得られたクローンのプロモーター領域をdeletion法で短くしたフラグメントを用いてルシフェラーゼアッセイを行ったところ、PTHによるU1プロモーター活性の低下作用には、転写開始点付近の25塩基対の配列が重要であることが示されたので、この配列をPTHSR(PTH suppressive region)と名付けた。また、ゲルシフトアッセイおよびミュータジェネシスの結果から、PTHSR中の12塩基対の配列に何らかのタンパク質が結合することがPTHRのプロモーター活性には重要で、PTHのシグナルによりこのタンパク質の結合性が不安定になることが示された。(4)p42/44MAPキナーゼ経路のシグナルによるU1プロモーター活性の低下作用に関与するシスエレメントは、エクソンU1-S間のイントロンおよびU1から上流6〜7kb付近の2ケ所存在することが示された。